基于蛋白质组学的帕金森病患者血浆生物学标志物研究

发布时间：2020-08-07 17:33

【摘要】：背景应用蛋白质组学方法,在细胞、组织、血液等体液中筛选出蛋白质表达谱,鉴定出有助于临床上诊断的生物学标志物。以质谱(Mass Spectrometry,MS)分析技术是一种高效的蛋白质组学研究方法。本研究利用高效液相色谱仪(High-Performance Liquid Chromatography,HPLC)联合The quadrupole Orbitrap mass spectrometer质谱仪(Q Exactive),筛选出早期帕金森病(Parkinson’s Disease,PD)组、中晚期PD组这两组实验组与对照组血浆样本之间表达水平具有差异性的蛋白质,寻找可能早期诊断帕金森病的生物学标志物。目的利用Q-Exactive质谱仪为基础上的质谱技术,筛选PD临床诊断和干预相关的生物学标志物。方法1临床样本的采集及制备选择2016年7月至2017年3月于新乡医学院第一附属医院神经内科就诊的PD患者33例,按照疾病分期将患者分为早期PD组(n=19)和中晚期PD组(n=14)。另选取同期36例健康体检者作为对照组。分别选取6名早期PD、6例中晚期PD、6例对照者的血浆样本,经过去除血浆中的高丰度蛋白质、蛋白浓缩、蛋白定量,于每个实验样本取出100μg相继进行蛋白还原及烷基化反应,加入1.5μg胰蛋白酶至每个样本中,37℃恒温箱中酶解过夜,酶解产物经过冻干及重溶,加入不同浓度梯度的乙腈至C18填充的固相萃取柱对样本进行脱盐处理。2液相分离及质谱检测利用富集柱对多肽样品进行富集,经过高温电离及电压雾化后进入QE质谱机器中进行检测,收集离子信号。离子信号经过软件处理并进行搜库。筛选出在每组6例中均出现、表达差异具有统计学意义的多肽作为最终结果(P0.05)。3生物信息学分析我们利用R语言中的Cluster Profiler包对表达水平差异性具有统计学意义的蛋白进行功能富集,主要包括Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)通路富集,对生物学过程、分子功能、细胞组分富集分别做分析Gene Ontology(GO)功能富集,以及蛋白质互作分析。4差异蛋白的ELISA验证为了验证质谱分析的结果,我们扩大样本。利用酶联免疫检测技术(Linked Immunosorbent Assay,ELISA),对三个表达具有显著性的蛋白,载脂蛋白E(apolipoprotein E,APOE)、过氧化物酶-2(peroxiredoxin-2,PRDX2),炎性反应蛋白补体C7(complement component 7,C7)进一步进行定量验证,求得相应样品所含有的蛋白浓度。结果我们筛选出97个早期组血浆中表达差异的蛋白质;筛选出68个中晚期组血浆中差异表达的蛋白质。通过生物信息学对差异蛋白进行分析后,发现这些蛋白功能主要与氧化应激反应、炎症反应、补体激活、神经突触再生等相关;ELISA结果:早期组和对照组中的受试者血浆中C7蛋白水平比较差异均无统计学意义(P0.05)。早期PD组患者血浆中APOE蛋白水平均低于对照组(P0.05),差异具有统计学意义;早期PD组患者血浆中PRDX2蛋白水平低于对照组(P0.01),差异具有统计学意义。结论1 PD患者与对照组血浆中蛋白质表达水平存在一定的差异性。2 APOE和PRDX2可能作为早期诊断帕金森病的标志物,仍需扩大样本验证。
【学位授予单位】：新乡医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R742.5
【图文】：

级联反应,凝血,信号通路

针对早期 PD 组与中晚期 PD 组分别与对照组比较，对这两组行 GO 分子功能分析两组中的差异蛋白的显著的分子功能均为与核酸或者蛋白质结合；行细胞组分功能集分析，发现两组中差异蛋白主要位于细胞囊泡和细胞膜上。运用 String 研究重复差异蛋白质之间是否具有相互作用关系，从而绘制了作用络图，如图 5 和图 6。从图中可以看出这些蛋白质处于一个网络中，相互之间有联系说明当某个蛋白质表达水平发生改变时，将会导致其他蛋白质的表达水平发生变化在疾病的发生、发展中有着密切联系。

信号通路

黏着斑信号通路

基于蛋白质组学的帕金森病患者血浆生物学标志物研究

KEGG-pathway分析

【参考文献】