p38MAPK参与α-synuclein A53T诱导的SN4741细胞线粒体稳态失衡的机制

发布时间：2020-08-08 04:52

【摘要】：背景帕金森病(PD)是最常见的神经退行性疾病之一,其发病率仅次于阿尔兹海默症(AD)。PD典型的病理特征为中脑黑质多巴胺能神经元的退行性死亡。该病在我国患病人数居世界第一,并以每年增加10万患者的速度递增,且该病治疗方法和效果均有限,因此PD给我国公共卫生事业带来了巨大的挑战。目前,越来越多的研究表明,α-synuclein的异常聚集和线粒体功能紊乱与PD的发病有关,但是其中的具体机制尚不清楚。丝氨酸/苏氨酸激酶p38MAPK在细胞内通过调控各种细胞信号通路的信号转导,影响着细胞内多种活动进程。已有研究表明,p38MAPK的激活与细胞内线粒体功能紊乱有关,但其中的具体机制尚不清楚。线粒体分裂对保持线粒体稳态,维持线粒体功能来说十分重要,而线粒体动力相关蛋白Drp1是调控细胞内线粒体分裂的一种重要的GTP酶。很多研究表明,在PD中,Drp1的激活导致线粒体分裂异常,从而导致线粒体和细胞的功能损伤。Drp1可受多种激酶的调控,其中p38lMAPK与Drp1的关系尚未有报道。本研究旨在阐明在PD中p38MAPK、Drp1与线粒体稳态之间的联系和具体调控机制,为帕金森病的治疗策略提供理论基础和新思路。目的1.探索α-synuclein对线粒体功能和细胞功能的影响;2.明确p38MAPK是否参与α-synuclein诱导的线粒体稳态失衡和神经元死亡;3.明确Drp1是否参与α-synuclein诱导的线粒体稳态失衡和神经元死亡;4.明确p38MAPK是否参与调控Drp1。方法1、Mito tracker染料标记细胞内线粒体2、JC-1检测SN4741细胞线粒体的膜电位3、流式细胞术检测细胞的凋亡水平4、质粒的转化、细胞内转染质粒5、蛋白免疫印迹法检测细胞内蛋白的表达水平6、细胞线粒体提取法检测蛋白在细胞内的分布7、免疫共沉淀法(Co-IP)检测细胞内两蛋白间的相互结合和作用结果1.α-synucleinA53T诱导SN4741细胞线粒体功能紊乱和细胞凋亡;2.α-synuclein A53T可激活p38MAPK,药物抑制或转染p38MAPK激酶失活型质粒均可恢复线粒体功能,减少细胞凋亡;3.α-synuclein A53T可激活Drp1,导致Drp1磷酸化和线粒体转位,且使用Drp1抑制剂可恢复线粒体功能,减少细胞凋亡;4.抑制p38MAPK可以抑制Drp1的活性,导致其磷酸化和线粒体转位减少;5.p38MAPK与Drp1可相互结合,α-synuclein A53T可导致二者结合增加,抑制p38MAPK可导致两者结合减少。结论α-synuclein A53T诱导激活p38MAPK,激活的p38MAPK通过诱导Drp1磷酸化及其线粒体转位激活Drp1,从而介导线粒体分裂异常,导致线粒体功能紊乱和神经元死亡。抑制Drp1和p38MAPK均可恢复线粒体功能,减少神经元死亡。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R742.5
【图文】：

细胞线粒体,过表达,形态变化,线粒体

使用线粒体染色试剂Ｍｉｔｏ邋ｔｒａｃｋｅｒ分别对转染了空载体质粒、Ａ５３Ｔ质粒的ＳＮ４７４１逡逑细胞的线粒体进行染色，以观察ａ－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ邋Ａ５３Ｔ过表达对线粒体形态的影响。逡逑如图１．１所示，在激光共聚焦显微镜下观察到的红色部分为线粒体。可以看到，逡逑与转染了空载质粒的对照组相比，转染了邋Ａ５３Ｔ的细胞中，点状的线粒体明显增逡逑多，线粒体的碎片化增多。用ｉｍａｇｄ软件进行分析后也发现，转染Ａ５３Ｔ的组细逡逑胞的线粒体平均长度明显小于对照组，且该差异具有统计学意义（ｐ＜０．０１，ｎ＝３）。逡逑此结果表明，ａ－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ邋Ａ５３Ｔ过表达导致ＳＮ４７４１细胞线粒体形态发生改变，即逡逑分裂增多，线粒体的碎片化增多。逡逑ＭＩＴＯ逡逑■ｍ逦ｒ，逦＾逡逑ｍＳｍ逦ｒ．逡逑１邋0逦ＡＳ３Ｔ逡逑图１．１邋ａ－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ邋Ａ５３Ｔ过表达处理ＳＮ４７４１细胞线粒体形态变化逡逑Ｆｉｇ．邋１邋？邋１邋Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ邋ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ邋ｗａｓ邋ａｓｓｅｓｓｅｄ邋ｕｓｉｎｇ邋ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ邋ｔｒａｃｋｅｒ邋ｉｎ邋ａ－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ邋Ａ５３Ｔ逡逑ＳＮ４７４１邋ｃｅｌｌｓ．邋Ｄａｔａ邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ邋ｍｅａｎ邋土邋ＳＤ邋ｏｆ邋ｔｈｒｅｅ邋ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ邋ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．逦＜邋０．０１．逡逑１．２邋ａ－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ邋Ａ５３Ｔ导致ＳＮ４７４１细胞线粒体膜电位下降逡逑为进一步探究ａ－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ邋Ａ５３Ｔ过表达对ＳＮ４７４１细胞线粒体功能的影响

细胞线粒体,过表达,膜电位

而线粒体的功能受到损害时，线粒体的跨膜电位被去极化，ＪＣ－１被释放，因而以逡逑单体的形式存在，表现为绿色荧光。因此，根据红绿荧光的强度，可检测出线粒逡逑体膜电位的变化。如图１．２所示，相比于转染了空载质粒的对照组，转染了邋Ａ５３Ｔ逡逑的细胞在镜下观察到的红色荧光明显减弱，绿色荧光增强。此结果说明转染了逡逑Ａ５３Ｔ的ＳＮ４７４１细胞的线粒体膜电位被去极化，膜电位降低。此结果表明过表逡逑达ａ－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎＡ５３Ｔ导致ＳＮ４７４１细胞的线粒体膜电位降低。逡逑ＪＣ－１邋ｍｏｍｏｍｅｒ邋ＪＣ－１邋ｐｏｌｙｍｅｒ邋Ｍｅｒｇｅ逡逑１邋：ｒｆ．邋／邋１邋逦二逦逡逑ＨＨ邋ｉ邋二逡逑图１．２邋ａ－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎＡ５３Ｔ过表达处理ＳＮ４７４１细胞线粒体膜电位变化逡逑Ｆｉｇ．邋１．２邋Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ邋ｍｅｍｂｒａｎｅ邋ｐｏｔｅｎｔｉａｌ邋ｗａｓ邋ａｓｓｅｓｓｅｄ邋ｂｙ邋ＪＣ－１邋ｉｎ邋ａ－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ邋Ａ５３Ｔ邋ＳＮ４７４１逡逑ｃｅｌｌｓ．邋Ｄａｔａ邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ邋ｍｅａｎ邋±邋ＳＤ邋ｏｆ邋ｔｈｒｅｅ邋ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ邋ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．邋＊＊＊ｐ邋＜邋０．００１．逡逑１．３邋ａ－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ邋Ａ５３Ｔ诱导ＳＮ４７４１细胞发生凋亡逡逑上述结果表明，ａ－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ邋Ａ５３Ｔ过表达可导致线粒体分裂增多，线粒体片逡逑段化增多，且线粒体的膜电位下降，提示着ａ－ｓｙｍｉｃｌｅｉｎＡ５３Ｔ过表达可导致逡逑ＳＮ４７４１细胞的线粒体稳态失衡。接下来

过表达,细胞凋亡

达对ＳＮ４７４１细胞功能的影响，我们分别对转染了空载体质粒、Ａ５３Ｔ质粒的逡逑ＳＮ４７４１细胞进行收集，随后，先后用Ａｎｎｅｘｉｎ－ＦＩＴＣ和ＰＩ两种染料对细胞进行逡逑染色，最后使用流式细胞仪对细胞的凋亡情况进行检测分析。如图１．３所示，转逡逑染了空载质粒的对照组，细胞凋亡率为７．１６％，而转染了邋Ａ５３Ｔ的处理组，细胞逡逑凋亡率达到了邋２５．３３％，细胞凋亡率明显上升。该差异具有统计学意义０＜0．0１，逡逑ｎ＝３）。因此可得出结论，ａ－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎＡ５３Ｔ过表达可诱导ＳＮ４７４１细胞发生凋亡。逡逑0１邋０２邋°１邋０２邋Ｍ逡逑０４９３％逦0３Ｍ％逦７Ｘ０％逦逦，逡逑ｉｏ３－逦．．＇潘逦ｉｏ３－逦r2？逦篆３０逦Ｉ逡逑２邋：：。厂逦Ｓ’逦丨：＿＿逡逑0：0４逦0３逦0逦0３逡逑逦邋逦２，＾，ｌ逦＂…丨邋Ｉ逦

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