CRMP5-293T细胞模型的构建及其在中枢神经系统脱髓鞘疾病中的意义

发布时间：2020-08-10 14:07

【摘要】：【背景】中枢神经系统(central nervous system,CNS)脱髓鞘疾病包括有视神经脊髓炎谱系疾病(neuromyelitis optica spectrum disorders,NMOSDs)、多发性硬化(multiple sclerosis,MS)、长节段横贯性脊髓炎(Longitudinally Extensive Transverse Myelitis,LETM)、视神经炎(optic neuritis,ON)等。目前临床上最常见的是视神经脊髓炎谱系疾病与多发性硬化。上述两者在发病机制,病理改变及治疗上都存在着差异。自从2004年有外国学者发现水通道蛋白4(aquaporin 4,AQP4)抗体后,该抗体被公认为NMOSDs最敏感且特异的免疫标志物。虽然该抗体的发现对鉴别NMOSDs与MS具有重要的指导意义,但临床上仍有10-40%的NMOSDs患者血清中检测不到该抗体。目前的研究表明这部分AQP4抗体阴性的NMOSDs患者的病因尚未明确,猜测可能有其他抗体参与或介导NMOSDs的病理过程,CRMP5(collapsin response mediator protein 5)抗体就可能是其中一种。第一部分:CRMP5的质粒组成及293T细胞模型的构建【目的】构建CRMP5质粒,将人CRMP5基因进行扩增后转染进人胚肾(human embryonic kidney,HEK)293T细胞内,构建出细胞模型并用于血清CRMP5抗体的检测。【方法】1.pEnter-CRMP5质粒的构建1.1.引物设计与合成通过软件Premier 5.0进行引物的设计并参照Genebank中公布的人CRMP5基因序列,分别设计CRMP5基因的上游及下游引物,其中上游含ASCI引物酶,下游含NotI引物酶,以18s rRNA为内参,送广州铭善上生物公司进行合成。1.2.人CRMP5基因的获取通过赛默飞公司的RNA提取试剂盒提取人体细胞的总核糖核苷酸(ribonucleic acid,RNA),为确保提取RNA的纯度和完整性需对其进行检测。之后用上述合成的CRMP5引物和人总RNA进行逆转录,从而得到它们的互补脱氧核糖核苷酸(complementary deoxyribonucleic acid,cDNA),再以CRMP5-cDNA为模板进行聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增。然后将PCR产物回收,进行凝胶电泳来鉴定目的基因是否扩增成功。1.3.酶切及质粒构建将CRMP5-cDNA的PCR回收产物及pEnter载体分别用ASC I与Not I限制性核酸内切酶进行双酶切,将CRMP5基因与pEnter载体通过T4连接酶进行连接后获得CRMP5-pEnter质粒,再以DH5α感受态细胞为底物,将质粒转化入内。将所得混合物加入含卡那霉素的LB平板内,置于含二氧化碳的37℃恒温培养箱中过夜培养,挑取单克隆细胞进行扩大培养后,通过Endo-free Plasmid Mini Kit II 50质粒提取试剂盒进行质粒提取并用于鉴定阳性克隆,同时以pEnter空载体做对照。1.4.pEnter-CRMP5质粒的鉴定将提取后的质粒进行双酶切筛选,通过琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒的完整性。然后将其送至广州铭善上公司进行基因测序,对GeneBank中人CRMP5基因序列和铭善上公司的检测结果进行Blast对比。2.CRMP5-293T细胞模型的构建将冻存在液氮的HEK 293T细胞复苏并进行培养,转染前1天对培养的293T细胞进行传代,培养至融合度达70-80%时,通过转染试剂Lipofectamine 3000将CRMP5质粒转染到293T细胞中。pEnter空载体做对照。3.CRMP5的表达鉴定转染成功的细胞通过Western blotting和间接免疫荧光法(indirect immunofluorescence assay,IIFA)鉴定CRMP5在293T细胞上的表达情况。成功构建的CRMP5-293T细胞模型将用于血清CRMP5抗体的检测。【结果】1.PCR扩增产物凝胶电泳鉴定:CRMP5-cDNA的PCR产物进行凝胶电泳鉴定,结果图中可见与理论值一致的条带(CRMP5:1695bp)。2.CRMP5质粒的鉴定2.1.质粒酶切凝胶电泳鉴定:电泳图显示在相应理论值附近出现清晰的条带,证明CRMP5质粒构建成功。2.2.基因测序分析鉴定:将基因测序结果与BLAST上的序列进行比对,原始序列与已知序列100%符合。3.CRMP5在细胞上的表达:Western blotting鉴定可见CRMP5-293T细胞表达蛋白在65kDa附近出现特异性条带。细胞经IIF法检测发现与CRMP5阳性抗体结合的细胞表面及细胞内激发红色荧光,与4'6-二脒基-2-苯基吲哚(4'6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染核叠加。而pEnter空载细胞,293T细胞以及空白对照的细胞上未见相应荧光模式。【结论】成功克隆人CRMP5基因,构建CRMP5-293T表达质粒,并在293T细胞上稳定表达,提示已经成功地构建出CRMP5-293T细胞模型。这是一种可靠的检测患者血清抗体的实验方法,为进一步深入研究NMOSDs可能存在的发病机制及病理变化提供有用的实验根据。第二部分:CNS脱髓鞘疾病患者血清CRMP5抗体检测【目的】通过构建的CRMP5-293T细胞模型检测CNS炎性脱髓鞘疾病患者血清中的CRMP5抗体,探索CRMP5抗体与该类疾病的关系。【方法】1.病例及血清收集收集2016年12月到2017年12月在广州医科大学附属第二医院诊断为CNS脱髓鞘疾病的患者共62例,所有患者均已进行血清AQP4抗体的检测。包括:NMOSDs 16例,MS 13例,其他炎症性神经系统疾病(other inflammatory neurological disease,OIND)患者15例、其他非炎症性神经系统疾病(other non-inflammatory neurological disease,OND)患者18例,另有健康对照20人。所有患者均未使用免疫抑制剂或糖皮质激素治疗,并在清晨空腹状态下静脉取血。2.血清中CRMP5抗体的检测基于细胞法(cell based assay,CBA)的间接免疫荧光方法检测患者血清中的CRMP5抗体,所用二抗为花青素荧光3(cyanine,CY3)标记鼠抗人IgG。3.商业型免疫印迹试剂盒验证细胞法检测的结果通过商业型免疫印迹试剂盒(神经元抗原谱2抗体(IgG)检测试剂盒)(EUROIMMUN,Neuronal Antigens Profile 2 EUROLINE)对上述所有标本进行检测,可见CBA法检测CRMP5抗体阳性的患者血清在印迹条上出现与理论值相符的目标条带,而抗体阴性患者未见目标条带,进一步证实了细胞模型的成功建立及患者血清CRMP5呈阳性。4.统计分析所有结果经过社会科学统计软件包(statistical package for social sciences,SPSS)16.0进行分析处理。本实验结果数据为分类变量资料,组间阳性率进行X~2检验,p小于0.05认为差异有统计学意义。【结果】CRMP5抗体与CNS脱髓鞘疾病的关系细胞免疫荧光法检测16例视神经脊髓炎谱系疾病(NMOSDs),阳性1例(6.25%);13例MS患者血清,阳性1例(7.69%);15例其他炎症性神经系统疾病(OIND),阳性0例(0%);18例其他非炎症性神经系统疾病(OND),阳性0例(0%);20例健康人对照,阳性0例(0%)。采用商业型免疫印迹试剂盒检测上述血清结果与CBA法检测结果完全一致。最后采用卡方检验评估各组阳性率,结果差异无统计学意义(p=0.316)。【结论】成功地构建了一种基于细胞转染的方法来检测血清中的CRMP5抗体,有助于临床诊断CRMP5抗体相关性疾病。
【学位授予单位】：广州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R744.5
【图文】：

基因产物,RT-PCR扩增,凝胶电泳,细胞

P5 质粒的构建和 CRMP5-293T 细胞模的条带(图 3)。由所作的灰度分3T 细胞和空载体 pcDNA3.1+ IIFA（indirect immunofluoresce表达 CRMP5 蛋白并与一抗（小二抗结合反应后在细胞质和胞合，而在空载细胞和未转染质光。证明转染 CRMP5-293T 细胞附图

序列,质粒,基因测序,基因

在 CRMP5 基因（1695bp）标记附近出现清晰的条带，说明 CRMP5 基因已成功载入 pEnter 质粒中。（图2）1.3.CRMP5 质粒基因测序鉴定将提取的 CRMP5 质粒送至广州铭善上生物公司进行基因测序，将所得结果与Genbank 中的人 CRMP5 基因序列进行 BLAST 对比分析可知：基因 CRMP5(1695bp)已成功克隆入至载体 pEnter 中，原始序列与 Genbank 中的已知序列 100%符合，提示该质粒可用于后续的实验。2. CRMP5 在 293T 细胞中的表达鉴定2.1.Western blotting 法鉴定采用Western blotting实验方法测定CRMP5的蛋白表达量，可检测到在分子量65kDa附近处出现 CRMP5-293T 细胞的特异性条带，而 293T 细胞及空载体 pcDNA3.1+ 处并未检测到特异性条带。以 GAPDH 为内参，分子大小约为 36 kDa，在各组 36 kDa 大小

鉴定结果,后产物,质粒

2: 双酶切鉴定 CRMP5 质粒泳道 M1：1kb DNA Ladder Marker；泳道 1：分别为 CRMP5-1 的质粒酶切后产物；泳道 2：分别为 CRMP5-2 的质粒酶切后产物；泳道 3：分别为 CRMP5-3 的质粒酶切后产物；泳道 4：分别为 CRMP5-4 的质粒酶切后产物；泳道 M2：DL2000 DNA Marker酶切结果分析：CRMP5（1695bp）在相应的位置切出一条目的条带（红色箭头所指到有阳性克隆，送 CRMP5 阳性质粒去测序。

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