血脑屏障紧密连接蛋白在颞叶癫痫中的作用机制

发布时间：2020-08-12 01:40

【摘要】：目的:癫痫是由于神经元突然异常放电引起,并可导致短暂性脑功能障碍的慢性疾病。海人酸(KA)诱导的颞叶癫痫模型已被广泛运用于研究癫痫疾病的发病机制。最近有研究表明,血脑屏障(BBB)已成为治疗癫痫的一个创新型研究方向。在KA诱导的癫痫模型中KA可引起神经元损伤和BBB损伤,但是关于癫痫相关的神经元损伤、自噬和BBB损伤之间的关联及相互作用机制的研究较少。因此,本文通过ICR雄性小鼠建立海人酸(KA)诱导的颞叶癫痫,于KA给药后测定海马CA3区神经元数量的变化、神经胶质细胞的活化、及自噬相关蛋白、BBB紧密连接(TJ)蛋白的表达,从而探讨了癫痫急性期神经元损伤,自噬相关蛋白表达与BBB相关蛋白变化之间的关系,从而进一步了解癫痫发病的相关病理改变。此外,这些试验结果为癫痫患者提供了新的治疗靶点,并为癫痫的治疗提供新的研究治疗方向。方法:将KA通过立体定位仪注射至每只小鼠的单侧侧脑室(相对于前囟的-1.0mm,-0.22mm和-0.3mm)。将成年的雄性ICR小鼠随机分为7组(每组n=14;7只动物用于组织学分析,7只动物用于生化分析)如下:生理盐水组(对照组),3μg/kg海人酸组(3μg/kgKA组),I0μg/kg海人酸组(10μg/kg KA组)。3天后处死生理盐水组(对照组),3μg/kg海人酸组(3μg/kg KA组),1Oμg/kg海人酸组。KA注射后,10μ_g/kgKA组根据时间再分为4个亚组(每组n=14;7组动物用于组织学分析,7组动物用于生化分析):6小时,24小时,48小时和72小时。注射后,将所有动物放回笼中,使用改良的Racine量表评估癫痫发作的严重程度:阶段0,正常行为;阶段1,小鼠禁止不动;第2阶段,前肢和/或尾巴伸展,肢体僵硬;第3阶段,头部不自主抖动;第4阶段,小鼠站立不稳;阶段5,小鼠持续失衡跌倒;阶段6,强直性发作甚至死亡。免疫组化实验检测NeuN标记的神经元核抗原、FJB标记损伤的神经元与Ibal标记的小胶质细胞、GFAP标记的星形胶质细胞、PECAM-1标记的血小板内皮细胞粘附分子1、ZO-1标记的胞质紧密粘连蛋白1,蛋白印迹法测定LC31/Ⅱ、Beclin-Ⅰ、Claudin5、ZO-1的蛋白表达。结果:(1)10μg/kg KA组小鼠有明显的癫痫发作,且其海马CA3区可见明显的神经细胞损伤。(2)在注射10μg/kg KA的小鼠中,KA注射后6小时海马中Beclin-1的蛋白质印迹表达水平自6小时KA注射后至48小时逐渐升高。然而,KA注射后72小时与KA注射后48小时相比有小幅下降。KA注射后6小时海马中的LC311/LC3I水平逐渐升高并且在24小时达到峰值;其蛋白水平在48和72小时逐渐下降,但仍高于对照组水平。(3)10μg/kgKA组的Iba-1免疫反应性显示为小的扁椭圆形的胞体,轴突细长呈分支状,且活化的小胶质细胞数量在海马CA3区中显著增加。在3μg/kg KA和10μg/kg KA组中,GFAP +细胞的活化和免疫反应性与对照组相比显著增加。(4)注射10μg/kg KA后24小时和48小时,海马CA3区PECAM-1免疫反应逐渐升高。注射10μg/kg KA 72小时后,其免疫反应性与48小时相比略有下降。在注射后24,48和72小时,这些组在海马CA3区的ZO-1免疫反应性中没有表现出差异,但是它们的免疫反应显着高于对照组和6小时组。(5)在注射后24,48和72小时,Claudin-5的蛋白水平显着高于对照组和6小时组。注射后6小时至72小时,海马中ZO-1蛋白水平与对照组相比逐渐升高。结论:(1)KA可诱导海马CA3区神经细胞损伤可能与自噬相关的Beclin-1和LC311水平的变化有关,这说明自噬参与了神经元的损伤。(2)KA诱导癫痫模型中观察到的星形胶质细胞和小胶质细胞活化,这可能与神经元死亡和BBB损伤有关。(3)TJ蛋白(如ZO-1和Claudin-5)及PECAM-1表达的短暂性增加可能与海马CA3区中神经元损伤相关。本实验的结果表明:KA诱导的海马CA3区神经元死亡与自噬有关。此外,星形胶质细胞及小胶质细胞的激活,PECAM-1,ZO-1和Claudin-5表达的早期短暂性增加可能与神经元损伤密切相关。然而,我们只评估了癫痫急性期自噬,BBB和神经元损伤的变化。需要进一步使用药物干预来验证自噬和BBB损伤在神经元死亡中的作用。这些结果将为治疗癫痫提供新的治疗靶点。
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R742.1
【图文】：

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本文编号：2789857