病理性α-synuclein沿泌尿生殖相关通路逆行播散导致小鼠多系统萎缩样表型的机制研究

发布时间：2020-08-12 15:59

【摘要】：背景多系统萎缩(multiple system atrophy,MSA)是一种原因不明的、少见的、致命的迟发性神经系统变性病,目前尚无有效的治疗方法。其临床症状主要表现为自主神经功能障碍、左旋多巴非敏感性帕金森症状及小脑性共济失调,常以某一系统损害为突出表现,伴随其他症状的相互叠加组合。迄今为止,MSA的发病机制仍然不明。MSA与帕金森病(Parkinson’s disease,PD),路易体痴呆(dementia with Lewy bodies,DLB),单纯性自主神经功能障碍(pure autonomic failure,PAF)等具有共同的病理特征,即错误折叠的α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)在神经系统中的异常沉积并在细胞内形成包涵体,这类疾病统称为α-突触核蛋白病。细胞及动物模型研究发现α-syn蛋白异构体可以像“朊蛋白”一样,诱导正常的α-syn蛋白异常折叠,形成包涵体,并在细胞间播散。因此,有学者提出α-syn阳性包涵体在中枢神经系统的形成及播散可能是α-突触核蛋白病共有的病理机制。临床统计学资料显示,大约65%的MSA患者的泌尿障碍出现时间早于运动障碍,且男性患者勃起功能障碍通常是首发症状,早于泌尿症状出现。MSA病程初期尿频、尿失禁的发生率为88%-100%,男性性功能障碍发生率为74%-84%。MSA的病理改变波及范围广泛,神经系统少突胶质细胞内存在α-syn阳性包涵体是其特征性病变。MSA患者尸检发现,除了在尾状核、壳核、苍白球、黑质、桥脑核、小脑浦肯野细胞等部位能测到α-syn阳性包涵体外,在导水管周围灰质(periaqueductal gray matter,PAG)、脑桥排尿中枢(pontinemicturition center,PMC)、L6-S1阶段骶副交感核(sacralparasympathetic nucleus,SPN)、脊髓中间外侧核(intermediolateral column,IML)、L6脊髓前角腹外侧Onuf核等泌尿生殖相关自主神经传导通路中也检测到α-syn阳性包涵体的存在,这可能是导致MSA患者早期出现泌尿生殖功能障碍的原因。因此,我们推测α-syn阳性包涵体可能从膀胱逼尿肌神经末梢沿泌尿生殖相关自主神经通路逆行播散至大脑导致MSA症候群。目的本实验通过构建转基因小鼠模型,研究α-syn阳性包涵体是否可以沿泌尿生殖相关自主神经通路逆行播散至大脑,模拟MSA患者的自主神经功能障碍及运动障碍,并进一步探讨MSA可能的发病机制。方法1.本研究收集了MSA患者8例,PD及进行性核上性麻痹(Progressive supranuclear palsy,PSP)患者各6例,以及正常对照组6例,收集其膀胱逼尿肌标本,通过免疫组织化学染色的方法检测其是否有病理性α-syn沉积。2.制备α-syn纤维体,并通过透射电镜鉴定其形态。3.建立转基因小鼠模型,将α-syn纤维体注射至小鼠膀胱逼尿肌,通过免疫组织化学染色、双重免疫荧光标记评估α-syn阳性包涵体的形成及播散情况,通过肛周肌电图、尿动力学检测、行为学测试评估小鼠的自主神经功能及运动功能改变。结果1.病人标本免疫组织化学染色显示病理性α-syn存在于MSA患者的膀胱逼尿肌神经末梢中,而PD、PSP及正常对照的逼尿肌中不存在。2.小鼠模型组织学结果显示,转基因小鼠的逼尿肌注射α-syn纤维体后,在小鼠的泌尿生殖自主神经通路上检测到α-syn阳性包涵体的沉积。3.小鼠模型行为学结果显示,实验组小鼠早期就能检测肛周肌电图异常及尿动力学异常,随后出现运动表型。结论1.在转基因小鼠模型中,α-syn阳性包涵体可以沿泌尿生殖相关自主神经通路逆行播散至大脑。2.在转基因小鼠模型中,α-syn阳性包涵体沿泌尿生殖相关自主神经通路的播散模拟了MSA患者自主神经功能障碍及运动障碍。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R741
【图文】：

病理性,病人,异常沉积,情况

结果T 中检测到病理性 α-syn 异常沉积 pα-syn 抗体和抗 α-syn filament 抗体检测病人及对照组 DET α-syn 的异常沉积（图 1）。在 8 例 MSA 患者中，有 6 例病人性的 α-syn 沉积物（图 1）。然而，我们未在 PD 及 PSP 病人理性的 α-syn（图 1）。此外，在 6 名对照组受试者的 DET 中性的 α-syn 沉积（图 1）。

包涵体,免疫组织化学染色,小鼠,情况

化学结果显示，少量 α-syn 包涵体沉积在 DET 及盆神经节，此外，在脊髓的 S1，L6 及 L2 水平检测到大量 α-syn 阳性包涵体，其主要存在于 V-VII 和 IX 板层；在脑中，α-syn 阳性包涵体存在于脑桥和中脑。我们的结果表明，α-syn 阳性包涵体沉积在泌尿反射相关通路上，包括 Onuf 核、IML、PAG、脑桥巴灵顿核（Barrington’s nucleus, BN）和 LC。此外，我们发现 α-syn 包涵体也沉积于锥体外系。这些与 MSA 尸检的病理结果是一致的。上述结果表明，病理性 α-syn 可以通过泌尿生殖自主神经相关通路逆向播散至大脑，导致广泛的 α-syn 阳性包涵体形成。然后，我们使用双重免疫荧光染色进一步探究 α-syn 组小鼠中的 α-syn 阳性包涵体的性质及分布特点（图 3）。首先，通过抗 pα-syn 抗体与泛素化抗体Ub 及小胶质细胞标记物抗 Iba-1 抗体的双重免疫荧光染色，我们发现 α-syn 阳性包涵体与 Ub 和 Iba-1 有共定位，提示泛素化及小胶质细胞激活参与了 α-syn阳性包涵体形成的病理过程；此外，我们观察到与 PBS 组相比，α-syn 组小鼠脊髓中 MBP 和 NF 的表达明显减少，提示在 α-syn 阳性包涵体的播散过程中，伴随着轴突病变及脱髓鞘改变。

分布情况,双重免疫荧光染色,小鼠,分布情况

图 3 通过双重免疫荧光染色检测各组小鼠不同层面 α-syn 的分布情况。A-B. L2, C. 小脑,D-E. L2, F. 脑桥, G. 中脑, 比例尺 500 μm (A1, C1); 200 μm (B1, F1); 100 μm(F2-F3); 50 μm(A2, B2, C2, D, E, G)。3α-syn 组小鼠早期出现 EAS EMG 失神经支配-神经再支配改变首先，使用 20 只年龄匹配的健康雄性 TgM83+/-小鼠作为正常对照，在这些小鼠中未检测到异常 EAS EMG。基于以往的文献，如果出现下列任意一种波形，则定义为异常的 EAS EMG：（1）纤颤电位；（2）正锐波；（3）复杂重复放电；（4）束颤电位；（5）肌颤搐；（6）卫星电位。结果显示，α-syn 组小鼠在造模后 2 个月即出现异常的 EAS EMG，而 PBS组中未检测到异常，差异有统计学意义（图 5, p<0.05）。我们进一步观察了 α-syn组小鼠中异常 EAS EMG 的出现率：在造模后 2 个月，4 个月及 6 个月时，分别

【相似文献】