超声辐射力神经生物学效应研究

发布时间：2020-08-14 18:16

【摘要】：神经退行性疾病(例如:阿尔茨海默症、帕金森病、癫痫等)严重危害人类健康与生命,目前该类疾病的治疗仍是一个世界性的医学难题。在我国,由于人口基数大,老龄化加剧等因素,神经退行性疾病患者数量加速增加,造成了严重的社会经济负担。因此,研究干预与治疗神经退行性疾病的新技术具有重要意义。近些年,超声辐射力作为一种新型无创神经调控技术被提出。与传统的电极刺激、磁刺激、光遗传学等神经调控技术相比,超声辐射力具备无创刺激、多点刺激、深部刺激的特点。但是,目前许多超声辐射力神经生物效应尚不明确,本论文从三方面研究经颅超声辐射力刺激引起的神经生物学效应:(1)经颅超声辐射力刺激对海马区神经元突触可塑性的影响;(2)经颅超声辐射力刺激对海马区神经元初级纤毛的影响;(3)经颅超声辐射力刺激对神经元自噬水平的影响。(1)背景:神经突触可塑性包括了功能与结构可塑性两个方面。以往研究证实,海马区神经元的突触可塑性与记忆功、学习、认知能力等密切相关,并在神经退行性病的发生与发展中扮演重要角色。但是,目前经颅超声辐射力刺激对海马区神经元突触结构与功能可塑性的影响并不清楚。目的:本论文研究经颅超声辐射力刺激能否调控神经元突触结构与功能可塑性。方法:利用经颅超声辐射力(换能器频率:0.5 MHz,脉冲重复频率:500 Hz,占空比:5%,声压:0.42MPa,超声空间峰值时间平均强度ISPTA:360 mW/cm2,空间峰值脉冲平均强度ISPPA:7.2W/cm2)对大鼠(对照组:n = 22,超声组:n = 22)刺激10天(10分钟/天)。利用高尔基染色评价神经元微结构树突棘的变化、利用离体膜片钳电生理技术检测神经元兴奋性突触后电流、利用蛋白质免疫印迹法检测离子通道型谷氨酸受体(G1uN2A,G1uN2B与G1uR1亚型)的表达、利用HE染色与尼氏染色评价经颅超声辐射力刺激安全性。结果:经颅超声辐射力刺激显著提高了海马CA1区椎体神经元树突棘密度(对照组:0.72 ± 0.17个/μm,超声组:0.94 ±0.19个/μm;p0.01)与兴奋性突触后电流的发放频率(对照组:0.37±0.14 Hz,超声组:1.77 ±0.37 Hz;p0.01),并且提高海马区离子通道型谷氨酸受体G1uN2A亚型的表达(p0.05)。HE染色与尼氏染色结果表明,与对照组比较,经颅超声辐射力刺激并未在皮层、海马区引发脑出血、组织损毁、神经元丢失等异常现象。结论:经颅超声辐射力刺激是一种调控神经元结构可塑性、功能可塑性、以及谷氨酸神经递质受体表达的可行技术。(2)背景:初级纤毛是一个位于细胞表面的细胞感受器,能够感知环境各种物理与化学信号,并将信号传导入细胞内,从而调整细胞内的稳态。神经元初级纤毛与大脑发育、功能和疾病密切相关。目前,尚无文献报道超声辐射力对神经元初级纤毛的影响。目的:本论文研究经颅超声辐射力刺激能否调控神经元的初级纤毛。方法:细胞实验中,利用不同参数超声辐射力刺激原代神经元(换能器频率:0.68 MHz,脉冲重复频率:500 Hz,占空比:5%,超声强度ISPTA:65mW/cm2或210mW/cm2,刺激时间:3小时或6小时)。利用免疫荧光染色评价超声辐射力刺激对原代神经元初级纤毛的影响。动物实验中,利用经颅超声辐射力(换能器频率:0.5 MHz,脉冲重复频率:500Hz,占空比:5%,声压:0.42MPa,超声强度ISPTA:360mW/cm2,超声强度 ISPA:7.2W/cm2)对大鼠(对照组:n= 10,超声组:n= 10)刺激10天(10分钟/天)。利用免疫荧光染色观察海马神经元初级纤毛,利用蛋白质免疫印迹检测纤毛相关ACIII蛋白的表达。结果:细胞实验中,利用强度ISPTA为65 mW/cm2的超声对原代神经元刺激3小时与6小时后,均显著性降低原代神经元初级纤毛的发生率(对照组:61.8%± 6.0%,3小时超声组32.6%± 13.5%,6小时超声组:12.1%±6.4%,p0.01),与减短初级纤毛的长度(对照组:4.2 ± 1.1,3小时超声组3.0±1.1μm,6 小时超声组:2.2±1.1μm,p0.01)。利用强度 ISPTA 为 65mW/cm2或210 mW/cm2的超声对神经元连续刺激3小时,均显著性降低原代神经元初级纤毛的发生率(对照组:68.5%±12.7%,65 mW/cm2超声组:30.4%±3.9%,210 mW/cm2超声组:9.3%±5.2%,p0.01),与减短初级纤毛的长度(对照组:4.2 ± 1.3 μm,65 mW/cm2 超声组 3.1 ± 1.3 μm,210 mW/cm2 超声组:2.3 ±1.1μm,p0.01)。动物实验中,经颅超声辐射力刺激显著降低海马CA1区神经元初级纤毛的发生率(对照组:35.1%± 6.6%,超声组28.9%± 4.6%,p0.05),与减短初级纤毛的长度(对照组:35.1%± 6.6%,超声组:28.9%±4.6%,p0.05)。另外,蛋白质免疫印迹检测结果表明,与对照组比较,超声辐射力刺激显著降低了海马区ACⅢ蛋白的表达(p0.05)量。结论:超声辐射力刺激能有效调控神经元初级纤毛,具备干预初级纤毛相关脑疾病的潜能。(3)背景:自噬是一种细胞自身清理异常蛋白、损伤细胞器、维持细胞内稳态的保护机制,普遍存在于哺乳动物细胞中,被称为Ⅱ型细胞死亡。研究证实,神经元自噬在阿尔茨海默症,帕金森症等神经退行性疾病的发生与发展中起着至关重要作用。目前,尚未有文献报道超声辐射力刺激对神经元自噬水平的影响。目的:本论文研究经颅超声辐射力刺激能否调控神经元的自噬水平。方法:细胞实验中,利用不同参数超声辐射力刺激原代神经元(换能器频率:0.68 MHz,脉冲重复频率:500 Hz,占空比:5%,超声辐射力刺激1秒,停止1秒,超声强度ISPTA:70 mW/cm2或165 mW/cm2,刺激时间:4小时或6小时),然后利用免疫荧光染色评价神经元自噬水平。动物实验中,利用经颅超声(中心频率:0.5 MHz,脉冲重复频率:500 Hz,占空比:5%,声压:0.42 MPa,超声强度ISPTA:360mW/cm2,刺激1秒,暂停1秒)对7月龄小鼠(对照组:n=14,超声组:n= 14)刺激4小时,取小鼠皮层与海马组织应用于蛋白质免疫印迹检测LC3B与p62蛋白(自噬标志物)。结果:细胞实验中,利用强度ISPTA为70 mW/cm2超声对原代神经元进行4小时或6小时刺激时,细胞自噬水平被显著性提高(对照组:1.00 ± 0.12,4小时超声组:1.37 ± 0.02,6小时超声组:1.50 ±0.03,p0.01)。利用强度ISPTA为70 mW/cm2或165 mW/cm2超声对原代神经元进行4小时刺激时,细胞自噬水平显著性提高(对照组:1.00 ± 0.08,70 mW/cm2超声组:1.45 ±0.08,165 mW/cm2超声组:1.61 ±0.02,p 0.01)。动物实验中,经颅超声辐射力刺激显著提高小鼠皮层区的LC3BⅡ/LC3BⅠ比例(对照组:1± 0.27,超声组:1.40 ±0.28,p 0.05)。另外,p62 与 LC3B 密切相关,随着自噬的提高p62蛋白会被特异性地降解。经颅超声辐射力刺激显著降低了小鼠皮层区p62蛋白的表达(对照组:1±0.13,超声组:0.79±0.07,p0.01)。在海马组织检测中,实验取得相似结果,经颅超声辐射力刺激显著性提高 LC3BⅡ/LC3BⅠ 比例(对照组:1± 0.17,超声组:1.30 ±0.27,p0.05),并降低p62蛋白表达(对照组:1± 0.13,超声组:0.82 ±0.09,p0.05)。结论:经颅超声辐射力刺激是一种调控神经元自噬水平的可行之法。综上所述,本论文明确了经颅超声辐射力刺激对神经元突触可塑性、初级纤毛、与自噬的生物效应,为超声辐射力神经调控提供新证据,为超声辐射力神经调控技术应用于神经退行性疾病的治疗奠定理论基础。
【学位授予单位】：中国科学院大学(中国科学院深圳先进技术研究院)
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R741.05
【图文】：

深部脑刺激,经颅磁刺激,电极

ＨＰ８Ｂ逡逑０ＨＨ逡逑图１．２基于ＭＲＩ的无框架立体定向神经导航技术的经颅磁刺激（Ｖａｌｅｒｏ－Ｃａｂｒｅ，邋２０１７）。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．２邋Ｔｒａｎｓｃｒａｎｉａｌ邋ｍａｇｎｅｔｉｃ邋ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ邋ｂａｓｅｄ邋ｏｎ邋ＭＲＩ－ｂａｓｅｄ邋Ｆｒａｍｅｌｅｓｓ邋ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ逡逑ｎｅｕｒｏｎａｖｉｇａｔｉｏｎ邋ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．逡逑４逡逑

经颅磁刺激,深部脑刺激

逑ＰＴ？Ｉ逡逑ｆｃｌＬ邋ｉｊｆｌｌ邋＾逡逑图１．１电极深部脑刺激（Ｌｅｗｉｓ，邋２０１６）逡逑（ａ）磁共振成像显示双侧深部脑刺激电极；（ｂ）胸部Ｘ光显示皮下植入刺激器逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．１邋Ｄｅｅｐ邋Ｂｒａｉｎ邋Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ逡逑（ａ）邋Ｍａｇｎｅｔｉｃ邋ｒｅｓｏｎａｎｃｅ邋ｉｍａｇｉｎｇ邋ｓｈｏｗｉｎｇ邋ｂｉｌａｔｅｒａｌ邋ｄｅｅｐ－ｂｒａｉｎ邋ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ邋ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓ；邋（ｂ）逡逑Ｃｈｅｓｔ邋ｒａｄｉｏｇｒａｐｈ邋ｓｈｏｗｉｎｇ邋ｔｈｅ邋ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ邋ｉｍｐｌａｎｔｅｄ邋ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ邋ｈａｒｄｗａｒｅ．逡逑１．１．３．２邋经颇磁刺激（Ｔｒａｎｓｃｒａｎｉａｌ邋Ｍａｇｎｅｔｉｃ邋Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ〉逡逑Ｂａｒｋｅｒ等（１９８５）第一次报道了基于法拉第电磁感应基本原理的无创经颅磁逡逑刺激技术，他们发现该技术能实现对人脑皮层神经刺激。该技术的主要工作原理逡逑是：将磁性线圈置于头部表面，通过改变线圈电流，从而形成高强度的脉冲磁场。逡逑该脉冲磁场具备足够穿透颅骨的能力，并作用于大脑皮层。经颅磁刺激能够影响逡逑皮层区神经细胞膜电位变化，形成相应的感应电流，产生各种神经生物学效应，逡逑实现神经调控作用（Ｖａｌｅｒｏ－Ｃａｂｒｅ，２０１７）。研究表明，经颅磁刺激具备干预与治疗逡逑抑郁症、成瘾治疗、精神分裂症的潜能。然而，该技术在刺激深度与刺激空间分逡逑辨率上存在不足。逡逑ＨＰ８Ｂ逡逑０ＨＨ逡逑图１．２基于ＭＲＩ的无框架立体定向神经导航技术的经颅磁刺激（Ｖａｌｅｒｏ－Ｃａｂｒｅ

黄光,蓝光,经颅磁刺激,深部脑刺激

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