乙硫氨酸引起神经管畸形发生过程中作用的初步研究

发布时间：2020-08-15 23:11

【摘要】：目的:1.检测乙硫氨酸腹腔注射C57BL/6孕鼠是否可以引起胎鼠神经管畸形(neural tube defects,NTD_S)的发生。2.从C57小鼠中提取原代神经干细胞(neural stem cells,NSCs),并进行培养、鉴定,为研究乙硫氨酸引起神经管畸形的研究提供细胞模型。3.通过研究乙硫氨酸对神经干细胞功能的影响,初步研究乙硫氨酸在其引起的C57BL/6小鼠胚胎神经管畸形发生过程中的作用。方法:1.通过腹腔注射的方式,将乙硫氨酸以100 mg/kg的剂量注入到C57BL/6怀孕第7.5天(E7.5)母鼠体内,然后继续饲养至E9.5、E10.5和E11.5时分别提取分离出完整的胚胎,通过体视显微镜及HE染色的方法观察及检测E10.5和E11.5时胚胎的前脑、后脑的闭合情况,对造模的结果进行验证。2.从孕E13.5天的C57胎鼠脑组织中,通过机械法提取原代NSCs,然后用悬浮细胞培养法进行体外培养;用免疫荧光染色法通过检测NSCs的Nestin特征蛋白来初步鉴定NSCs;然后再次用免疫荧光染色法检测其分化后神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的特征蛋白来进行进一步的NSCs分化鉴定。3.将乙硫氨酸加入到神经干细胞的增殖培养基中,将实验分为两组:对照组(正常培养的NSC组)、实验组(加乙硫氨酸培养的NSC组),两组细胞各培养一段时间,在荧光显微镜下观察其细胞形态并摄片,在Image-J软件下,随机选取每组5-10个不同的视野进行神经球的计数并用GraphPad Prism 5软件分析作图,以此观察其集落形成能力、神经球的形成比例以及细胞的生长状态,初步推断乙硫氨酸对神经干细胞的增殖的影响。4.通过Cell Counting Kit-8法(CCK-8法)检测实验组和对照组的细胞增殖变化情况;5.通过流式细胞术检测实验组和对照组的细胞凋亡的变化情况。6.通过Western blotting蛋白印迹法法检测Caspase 3蛋白表达变化。7.通过流式细胞术检测实验组和对照组的细胞周期的变化情况。8.通过免疫荧光的方法检测实验组和对照组两组分化情况的差异。9.统计学分析方法:数据均用均数±标准差(X±S)表示,统计学分析采用SPSS17.0软件,两个样本均数间差异采用t检验,多个样本均数采用方差分析,*表示P0.05,**表示P0.01,***表示P0.001,当P0.05时可认为差异具有统计学意义。数据作图使用GraphPad Prism 5软件以及Image-J灰度值分析软件。结果:1.乙硫氨酸腹腔注射怀孕E7.5的C57BL/6孕鼠,成功诱导出小鼠NTDs,最佳致剂量为100 mg/kg,NTDs发生率为54.7%,小鼠NTDs主要表现为颅面畸形和发育迟缓,其它畸形有后脑神经管未闭、前脑发育不足等;HE染色可见神经管畸形胎鼠前后脑泡未闭合,结构异常。2.原代提取的NSCs生长状态良好。Nestin免疫荧光染色呈阳性;NSCs分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的特征性蛋白NF-H、MAP2、GFAP和GALC,结果也均呈阳性显色。3.实验组和对照组在集落形成能力和神经球的形成比例上均有差异,最佳添加浓度为10 mmol/L;对照组集落形成能力显著高于实验组,差异具有统计学意义(12.60±1.074 vs.5.50±0.893,t=10.80,P0.05)。实验组直径小于100μm的神经球的数量虽比对照组的多,但对照组在直径大于100μm的神经球的数量上的远多于实验组,差异具有统计学意义(P0.05)。4.CCK-8法结果得出:实验组0 h时的吸光度值(OD)与对照组无明显差异,而接下来的1-5天的OD值,实验组则显著低于对照组,差异具有统计学意义(1d:t=7.227,P=0.0019;2d:t=8.855,P=0.0009;3d:t=15.95,P0.0001;4d:t=31.83,P0.0001;5d:t=9.017,P=0.0008)。表明乙硫氨酸显著降低了NSCs的增殖能力,差异有统计学意义(P0.05)。5.流式结果显示:早凋率和晚凋率的变化与时间成正比例关系,随着NSC_S体外给予乙硫氨酸干预时间的延长,早凋率和晚凋率都逐渐升高,总凋亡率也随着NSC_S体外给予乙硫氨酸干预时间的延长逐渐升高,差异有统计学意义。(总凋亡0 h vs.72h:P=0.0037,总凋亡48 h vs.72 h:P=0.0141,总凋亡0 h vs.48 h:P=0.0084)。6.Western blotting法显示,在Caspase3蛋白表达量上,实验组比对照组高,P0.01,差异有统计学意义。7.流式结果显示:处于G1期的细胞数,实验组显著高于对照组(P0.0001),而处于S和G2期的细胞数,实验组显著低于对照组(P_S=0.0002,P_(G2)=0.0021),差异具有统计学意义。实验组的细胞被捕获在了G1期,无法进入S期。8.免疫荧光结果显示:实验组向神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞分化的能力都低于对照组。结论:1.乙硫氨酸腹腔注射可引起C57BL/6胎鼠NTD_S,提示叶酸的甲硫氨酸循环代谢障碍与NTD_S发育有关,且此模型的建立为后续研究甲硫氨酸循环障碍与NTD_S的关系即乙硫氨酸在NTD_S中的作用提供了动物模型依据。2.经过一系列的提取、培养、鉴定,成功的为后面的实验提供了可靠的细胞模型。3.通过研究乙硫氨酸对神经干细胞的细胞功能的影响,初步表明乙硫氨酸可能通过引起神经干细胞的增殖减少,凋亡增多及干扰神经干细胞的分化功能在引起C57BL/6小鼠胚胎神经管畸形的发生过程中发挥了一定的作用。
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R748
【图文】：

胎鼠,前脑,后脑,脑部

图 1-2 E10.5 胎鼠及 HE 染色图图 1-2：E10.5 胎鼠 HE 染色图。A：E10.5 正常胎鼠（×4）；B：A 图对应的脑部 HE 染色图（×25C：A 图对应的前脑 HE 染色图（×48）；D：A 图对应的后脑 HE 染色图（×48）；E:E10.5 畸胎鼠（×48）；F：B 图对应的脑部全胚胎染色图（×25）；G：B 图对应的前脑 HE 染色图（×48H：B 图对应的后脑 HE 染色图（×48）

胎鼠,前脑,后脑,脑部

图 1-2 E10.5 胎鼠及 HE 染色图图 1-2：E10.5 胎鼠 HE 染色图。A：E10.5 正常胎鼠（×4）；B：A 图对应的脑部 HE 染色图（×25）；C：A 图对应的前脑 HE 染色图（×48）；D：A 图对应的后脑 HE 染色图（×48）；E:E10.5 畸形胎鼠（×48）；F：B 图对应的脑部全胚胎染色图（×25）；G：B 图对应的前脑 HE 染色图（×48）；H：B 图对应的后脑 HE 染色图（×48）

过程图,显微镜下,过程

图 2-1 显微镜下提取 NSCs 过程（×40）小鼠双侧子宫取出的串珠状子宫；B：剥离了蜕膜组织的完整胎鼠离颅骨暴露出的脑组织；D：剥离脑膜后底面观察到的完整脑组织胞培养时的形态学观察 NSCs 细胞初时呈圆形，体积较小，胞体透明，折光性强 A）。经两三天的培养，圆形细胞的体积逐渐增大，6-10成哑铃状，细胞形态慢慢变圆，细胞球虽不大，但开始形成（胞纯度高，状态好，增殖快，形成的细胞球数量越来越多成较大细胞球（图 2-2 C）。由于球体中心部比较膨隆立代以后有些大的细胞球因为紧紧形成一个独立体，营养无态变差（图 2-2 D）。

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