脑白质疏松患者的肾素血管紧张素系统基因多态性和血流动力学研究

发布时间：2020-08-17 12:47

【摘要】：目的:随着人口老龄化的进程,脑小血管病成为神经科的研究热点,而脑白质疏松是脑小血管病中以影像学特征命名的一组临床综合征。虽然脑白质疏松患者早期是无症状的,而病变却是非良性病变,与临床的不良结局有关,如运动障碍,痴呆,抑郁,脑卒中及总体患病率和死亡率的增加。近几十年来,学者们围绕着脑白质疏松的发病机理展开了大量的研究,探讨遗传因素和脑血流动力学的改变等,但是仍然没有定论。目前关于脑白质疏松基因多态性的诸多研究表明,遗传因素对脑白质疏松的发生也是至关重要的。肾素血管紧张素系统可以调节血压及血管的紧张性,对动脉粥样硬化形成起非常重要的作用,因此引发学者们的关注。肾素血管紧张素系统包括血管紧张素转换酶(ACE),血管紧张素原(AGT)及血管紧张素Ⅱ1型受体(AGTR1)。许多研究指出肾素血管紧张素系统的基因多态性与心脑血管疾病和高血压病具有相关性,并且与脑白质病变紧密相关。另外,学者们经过大量研究认为脑白质疏松是由于脑血管储备功能受到损伤,颅内低灌注,进而出现一系列临床表现。由于经颅多普勒超声检查具有简便快捷等优点,许多学者借助经颅多普勒超声观察大脑中动脉的血流速度、搏动指数等参数判断脑白质疏松患者颅内大动脉的血流改变及动态演变。结果发现脑白质疏松患者的大脑中动脉血流速度下降,搏动指数增高。有学者们通过经颅多普勒超声观察社区老年人的脑血流调节功能,并且探讨脑血流调节功能与肾素血管紧张素系统基因多态性的关系。因此,为了探讨肾素血管紧张素系统基因多态性与脑白质疏松的关系,本研究检测脑白质疏松患者肾素血管紧张素系统ACE-rs4311、rs4362、rs4461142、rs8066114、rs4646994,AGT-rs699、rs4762,AGTR1-rs5182、rs5186这9个位点的单核苷酸多态性,为缺血性脑白质疏松在遗传方面的发病机制研究提供更多的理论依据。另外,本课题在同一组研究对象中筛选受试者通过经颅多普勒超声仪做屏气试验,评估中国北方汉族症状性脑白质疏松患者的血流动力学改变,探讨屏气指数与脑白质疏松患者影像表现之间的关系。本研究诣在从血流动力学的角度与基因研究结果相结合,揭示脑白质疏松的发病机制。研究方法:本研究为横断面研究。选择2016年11月-2017年10月期间,在中国北方城市沈阳市第五人民医院神经内科住院及门诊就诊的汉族患者414例,年龄为43-93岁,其中男性220名,女性194名。按照严格的入选及排除标准选择患者,参照Fazekas分级标准依据头磁共振T2 FLAIR的表现对病变部位和病变程度进行轻重程度判断,将患者分为0级,I级,II级,III级,即0级为无脑白质疏松,I级为轻度脑白质疏松(脑白质点状病变),II级为中度脑白质疏松(早期融合病变),III级为重度脑白质疏松(片状融合病变)。然后按照既往已经验证的方法,参照Yadav,Traylor等团队关于脑白质疏松基因研究的分组标准,将Fazekas II级与III级合并,等同于多发性腔隙性脑梗死合并融合性脑白质病变,作为缺血性脑白质疏松病例组,Fazekas 0级与I级合并等同于孤立性腔隙性脑梗死(颅内点状病变),作为缺血性脑白质疏松对照组。同时尽量满足不同组别患者具备相同的性别、年龄及各种脑血管病易患因素,以减少各种混杂因素的影响。对肾素血管紧张素系统ACE-rs4311、rs4362、rs4461142、rs8066114,AGT-rs699、rs4762,AGTR1-rs5182、rs5186这8个位点采用SNaPshot分型技术检测单核苷酸多态性,对ACE-rs4646994位点采用PCR技术进行分型鉴定。然后采用SPSS 24.0(IBM公司)软件及SHEsis在线分析软件进行统计分析。对各位点进行哈迪-温伯格平衡检验,统计分析各位点基因型及等位基因在病例组与对照组的频率分布,进行连锁不平衡分析及单倍型分析。应用Logistic逐步回归分析评估各位点基因型和等位基因与脑白质疏松发病危险性的关系。然后,在同一组研究对象中筛选适合的患者应用经颅多普勒超声仪做常规检查和屏气试验,观察患者两侧大脑中动脉血流速度在屏气30秒前后的变化,记录平均血流速度,计算屏气指数。观察脑白质疏松患者的临床表现与影像表现之间的关系,评估屏气指数与头磁共振轻重程度的关系。结果:1.肾素血管紧张素系统的9个位点中只有ACE-rs4461142基因型CC,CT及TT在病例组与对照组的P0.05(P=0.048),有统计学意义。而其他8个位点的基因型在病例组与对照组的P值均0.05,没有统计学意义。另外,所有9个位点的等位基因在病例组与对照组的P值均0.05,没有统计学意义。2.ACE-rs4362的TT基因型(OR=2.674,95%CI:1.267~5.649,P=0.010),在控制各种混杂因素后,对缺血性脑白质疏松的发病危险度是CC基因型的2.674倍;T等位基因(OR=1.228,95%CI:1.038~1.454,P=0.017)在控制各种混杂因素后,对缺血性脑白质疏松的发病危险度是C等位基因的1.228倍。3.ACE-rs4461142的T等位基因(OR=1.190,95%CI:1.008~1.404,P=0.039)在控制各种混杂因素后,对缺血性脑白质疏松的发病危险度是C等位基因的1.190倍。4.AGTR1-rs5182的T等位基因(OR=1.527,95%CI:1.049~2.217,P=0.027)在控制各种混杂因素后,对缺血性脑白质疏松的发病危险度是C等位基因的1.547倍。5.rs4311-rs4362为强连锁不平衡(r~20.6);rs4311-rs4646994,rs4362-rs4646994,rs4362-rs4461142,rs4311-rs4461142及rs5182-rs5186为较强的连锁不平衡(r~20.1);其他为较低的连锁不平衡。6.rs5182-rs5186的3种单倍型T-A,C-A,C-C,病例组与对照组不具备统计学意义(P0.05)。7.脑白质疏松的影像严重程度与认知功能受损相关,脑白质疏松的影像表现越重,认知功能受损越明显。8.随着脑白质疏松的影像表现加重,屏气指数下降。9.在控制了年龄、冠心病及脑卒中病史后,屏气指数与脑白质疏松仍然具有相关性(P0.05),与脑白质疏松独立相关。结论:1.ACE-rs4362的TT基因型和T等位基因可能增加中国北方汉族人群缺血性脑白质疏松的发病风险。2.ACE-rs4461142的T等位基因可能增加中国北方汉族人群缺血性脑白质疏松的发病风险。3.AGTR1-rs5182的T等位基因可能增加中国北方汉族人群缺血性脑白质疏松的发病风险。4.ACE rs4311-rs4362为强连锁不平衡。5.屏气指数下降可能与中国北方人群脑白质疏松独立相关。
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R742
【图文】：

实验原理,样本

图 2.1 SNaPshot 实验原理图解本试验技术流程：ACE- rs4311、rs4362、rs4461142、rs8066114，AGT- rs699、rs4762，AGTR1-rs5182、rs5186：DNA 样本的质量评估——PCR 引物设计——PCR 循环——PCR产物纯化 ——SNaPshot 多重单碱基延伸反应 —— 延伸产物的纯化——ABI3730XL 测序——GeneMapper 4.1 分析ACE-rs4646994 位点：设计PCR 引物——PCR扩增——琼脂糖凝胶电泳——测序验证2.4.2 SNaPshot 技术实验过程DNA样本取1μl 1% 琼脂糖电泳对其样本进行质量检查以及浓度估计，然后根据估计的浓度将样本稀释到工作浓度5-10ng/μl。然后进行多重PCR反应，PCR引物设计如表2.1所示：表 2.1 引物序列及 PCR 长度

设计图,引物,产物,混合物

延伸反应：延伸反应体系（10μl）包括5μl SNaPshot Multiplex Kit(ABI), 2μl 化后多重PCR产物，1μl 延伸引物混合物，2μl 超纯水。延伸引物混合物中各延伸引物的浓度均为0.8。延伸反应程序：96℃变性1min，96℃变性10s，55℃退火5s，60℃延伸30s共28个循环；然后4℃保存。延伸产物的纯化：在10μl 延伸产物中加入1U SAP酶，37 ℃温浴1小时, 后75℃灭活15分钟。2.4.3 ACE-rs4646994 位点的技术过程首先设计图2.2中下划线序列的PCR引物：rs4646994 F:5’CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT3’R:5’GATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT3’

凝胶电泳,分子量,博士学位论文,标本

中国医科大学博士学位论文号为 2-16 到 2-30 号标本。Lane17， DL2000 分子量 marker。第三排，每隔一列上样跑胶 Lane1：2-31； Lane3：2-32； Lane5:2-33；Lane7：2-34；Lane9：2-35； Lane11：2-36， Lane13：2-37， Lane15：2-38。Lane 17： DL-2000 分子量marker。3.2.2 ACE- rs4646994 的凝胶电泳图（图 3.2）

【相似文献】