血液成分在脑室出血后急性白质损伤中的作用及机制研究

发布时间：2020-08-18 14:02

【摘要】：研究背景脑室出血(intraventricular hemorrhage,IVH)是血液进入脑室系统而引起的常见的神经外科疾病,分为原发性IVH和继发性IVH。原发性IVH主要是指脉络丛血管破裂引起的出血,比较少见。而脑实质内的出血如脑出血(intracerebral hemorrhage,ICH)和蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)破入脑室称之为继发性IVH,比较常见。大约40%的ICH患者和高达70%的SAH患者合并IVH,IVH的出现与ICH和SAH患者高死亡率密切相关,而且也是ICH和SAH患者神经功能障碍发生的重要因素。然而,目前IVH损伤的机制研究并不透彻,明确IVH后脑损伤的发生机制及探索可能有效的干预靶点对于改善IVH患者的预后具有十分重大的意义。中枢神经系统是由灰质和白质构成,灰质和白质大约各占50%。灰质主要是由神经元的胞体和无髓鞘的轴突组成,而白质则是由髓鞘包裹的轴突和支持细胞组成,这些支持细胞主要有少突胶质细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞组成。普遍认为白质的功能主要是协调灰质间联系和神经活动。越来越多的临床医生和基础研究的学者认为白质损伤在多种神经系统疾病中存在,而且白质损伤与患者的预后密切相关。但是,IVH后是否存在白质损伤及其损伤机制尚未有深入的探讨。血液成分及其代谢产物在出血性脑卒中后的脑损伤发挥着重要作用。出血性脑卒中,一方面红细胞在补体活化和膜攻击复合物(membrane attack complex,MAC)作用下早期即可发生裂解,从而释放出血红蛋白(hemoglobin)和铁(iron)等游毒性代谢产物引起脑组织的损伤,米诺环素(minocycline)则与铁螯合,从而阻断铁沉积所引起的组织损伤。血液中的血浆成分,尤其是凝血酶(thrombin)也可引起脑组织的损伤。SCH79797是蛋白酶活化受体-1(protease-activated receptor,PAR-1)的抑制剖,可以阻断 thrombin 引起的损伤作用。然而这些血液成分在IVH后白质损伤中的作用缺乏相关报道。随着血液代谢成分在出血性脑卒中作用的认识不断加深,越来越多的研究发现了以不同血液成分为靶点的药物。肝素(heparin)一方面可以与补体蛋白结合,抑制其活性,从而减少了红细胞的裂解,另一方面可以与凝血酶结合并抑制其活性。然而,肝素能否有效的改善IVH后的白质损伤仍有待于进一步研究。本研究将以IVH后白质损伤为主要切入点,观察大鼠实验性IVH后白质损伤标记物的改变,探讨血液成分在白质损伤机制中的作用,并使用肝素、SCH79797、米诺环素进行不同靶点的干预,观察IVH后白质损伤标记物的变化,为临床治疗IVH提供可靠的干预靶点和思路。实验方法第一部分1.采用侧脑室注射自体血的方法建立大鼠脑室出血模型,成年雄性SD大鼠被随机分为生理盐水对照组(Saline组),自体血组(IVH组);分别将200μl生理盐水、自体血通过脑立体定位仪缓慢注入大鼠右侧侧脑室,于24小时后行7.0TMRI扫描,扫描序列为T2,ImageJ测量白质区域(胼胝体)T2高信号的体积。采用HE染色、组化、Western blot、RT-PCR方法检测白质损伤的标记性蛋白MBP等关键蛋白、炎症反应和凋亡的改变情况。2.采用侧脑室注射浓缩红细胞和裂解红细胞的方法建立大鼠脑室出血模型,成年雄性SD大鼠被随机分为浓缩红细胞组(Packed RBC组),裂解红细胞组(IVH组);分别将50μl浓缩红细胞组、裂解红细胞通过脑立体定位仪缓慢注入大鼠右侧侧脑室,于24小时后行7.0T MRI扫描,扫描序列为T2,Image J测量白质区域(胼胝体)T2高信号的体积。采用免疫组织化学方法检测白质损伤的标记性蛋白MBP等改变。第二部分1.建立大鼠脑室内铁离子注射模型,观察铁离子注射后的白质损伤情况:成年雄性SD大鼠被随机分为生理盐水对照组(Saline组),三氯化铁(Iron组)和三氯化铁+米诺环素组(Iron+minocycline),分别将上述200μl溶液注入大鼠右侧侧脑室内,三氯化铁的浓度为0.5 mM,米诺环素的浓度为1.5 mM,于24小时后行7.0T MRI扫描,扫描序列为T2,Image J测量白质区域(胼胝体)T2高信号的体积。采用免疫组织化学方法检测白质损伤的标记性蛋白MBP、dMPB、β-APP的表达。2.建立大鼠脑室内凝血酶注射模型,观察凝血酶注射后的白质损伤情况:成年雄性SD大鼠被随机分为生理盐水对照组(Saline组),凝血酶(Thrombin组)和凝血酶+SCH79797组(Thrombin+SCH79797),分别将50μl溶液注入大鼠右侧侧脑室内,凝血酶为3 units,SCH79797的浓度为0.15 nM。于24小时后行7.0TMRI扫描,扫描序列为T2,ImageJ测量白质区域(胼胝体)T2高信号的体积。采用免疫组织化学方法检测白质损伤的标记性蛋白MBP、dMPB、β-APP的表达。第三部分1.采用侧脑室注射自体血的方法建立大鼠脑室出血模型,成年雄性SD大鼠被随机分为生理盐水(Saline组),自体血组(IVH组)和自体抗凝血组(heparinied blood);分别将200μl生理盐水、自体血和自体抗凝血组通过脑立体定位仪缓慢注入大鼠右侧侧脑室,于24小时后行7.0T MRI扫描,扫描序列为T2,Image J测量白质区域(胼胝体)T2高信号的体积。采用Western blot方法和TUNAL染色分别检测白质损伤的标记性蛋白MBP、dMPB、β-APP的表达和白质束内凋亡细胞的情况。结果第一部分1.侧脑室自体血注入法成功建立大鼠实验性IVH模型,IVH大鼠白质束内有大量红细胞聚集,白质束发生断裂,结构排列紊乱,血脑屏障发生破坏;自体血注入后24小时白质区域T2高信号的体积明显增加;IVH后白质束内白质损伤的标记物如髓鞘基础蛋白MBP表达降低,损伤的髓鞘基础蛋白dMBP和轴突损伤的标记性蛋白β-APP表达增加;白质束内出现NLRP3炎症小体活化和炎症因子表达的增加;白质束内凋亡的成熟少突胶质细胞的数目增加,这些结果提示IVH后24小时即出现了白质损伤,炎症反应和成熟少突胶质细胞的凋亡参与了这一过程。2.侧脑室注入裂解红细胞后白质区域T2高信号的体积明显增加;白质损伤髓鞘基础蛋白MBP表达降低,损伤的髓鞘基础蛋白dMBP和轴突损伤的标记性蛋白β-APP表达增加;这些结果提示裂解红细胞注入侧脑室可引起白质损伤。第二部分1.侧脑室内注射铁可导致严重的白质损伤,具体的表现有白质束内T2高信号的体积增加,MBP阳性染色面积减少,dMBP和β-APP的染色分级增加,铁的螯合剂米诺环素可明显减少侧脑室铁注射所引起的白质损伤。2.侧脑室内注射凝血酶可导致严重的白质损伤,具体的表现有白质束内T2高信号的体积增加,MBPP阳性染色面积减少,dMBP和β-APP的染色分级增加,PAR-1抑制剂SCH79797可明显减少侧脑室凝血酶注射所引起的白质损伤。第三部分1.肝素可以减轻脑出血后的白质损伤,主要的表现有白质束内T2高信号的体积减少,MBP蛋白的增加和dMBP和β-APP的表达的下降,同时肝素还可以减少白质束内细胞的凋亡。结论第一部分IVH发生后的急性期即存在着严重的白质损伤,NLRP3炎症小体活化所介导的炎症反应和少突胶质细胞的凋亡参与了这一病理生理过程。而且在急性期白质损伤的发生过程中,红细胞尤其是裂解的红细胞发挥着至关重要的作用。第二部分铁离子和凝血酶脑室内注射后均可引起明显的白质损伤,而且铁螯合剂米诺环素和PAR-1的抑制剂SCH79797可减轻铁和凝血酶所引起的白质损伤,提示着铁和凝血酶在脑室出血后急性白质损伤中发挥着重要的作用。第三部分肝素可以有效地减轻大鼠脑室出血后的白质损伤,肝素有可能成为脑室出血患者临床治疗新的选择。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R743.34
【图文】：

图１－１邋ＩＶＨ后Ｔ２邋ＷＩ改变和ＨＥ染色

Ｉ严：灄１逡逑ＩＶ邋Ｈ邋．逦＊逦？邋，；逦．邋？逦：．逦－逦－邋／邋－逡逑图１－１邋ＩＶＨ后Ｔ２邋ＷＩ改变和ＨＥ染色。我们可以观察到ＩＶＨ大鼠白质束出现明逡逑显的高信号改变。ＨＥ染色可见白质束内大量的红细胞聚集，白质束存在广泛的逡逑断裂，肿胀和结构排列的紊乱。Ｓｃａｌｅｂａｒ＝２００ｎｍ（４．０Ｘ）／２０｜ａｍ（４０Ｘ）。逡逑２７逡逑

逦Ｉ逦Ｉ逡逑图１－２相对于Ｓａｌｉｎｅ组而言，我们可以观察到ＩＶＨ大鼠白质束Ｔ２高信号的体积逡逑明显增加。＊＊ｐ＜０．０１邋ｖｓ邋Ｓａｌｉｎｅ，邋ｎ＝６。逡逑２８逡逑

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