自噬抑制胶质瘤起始细胞的自我更新能力和致瘤性并促进Notch1降解

发布时间：2020-08-23 12:33

【摘要】：胶质母细胞瘤(Glioblastoma,GBM)是最常见的原发性中枢神经系统恶性肿瘤,预后不良。目前的标准治疗包括肿瘤的最大安全切除,同步放化疗和随后的替莫唑胺序贯化治疗。尽管针对GBM的靶向治疗和免疫治疗已取得初步进展,然而GBM患者的中位生存期仅为14.6个月。胶质瘤干细胞,又称胶质瘤起始细胞(glioma initiating cells,GICs),具有自我更新、无限增殖、多潜能分化和强致瘤能力,与GBM对化疗和放疗的抗性密切相关。Notch通路在维持GIC自我更新和致瘤性方面担当很重要的角色。当Notch通路高度活化时,GIC得以维持自身干性表型。尽管在治疗早期,靶向Notch通路的治疗被发现能够抑制低氧肿瘤微环境的形成并促进肿瘤细胞凋亡,但对经历长期治疗的GBM患者却无明显益处。这可能是由于单靶点抑制Notch通路是不够的,GIC可以借助其他潜在通路激活维持生存。因此,本研究将讨论Notch通路治疗的新机制。自噬是一种进化上保守的依赖溶酶体的生物学行为,能够促进长寿命蛋白质和功能障碍细胞器的降解,并有助于细胞新陈代谢。在癌症中,自噬具有关键作用,因为它可以阻止肿瘤进展。最近,自噬已被证明可促进GICs的分化和减弱自我更新。然而,自噬如何调控GICs的自我更新和致瘤性还不是很清楚。在本研究中,我们评估了GIC维持自我更新背景下,自噬和Notch1通路之间的关系。我们首次发现自噬抑制GIC自我更新和致瘤性,并证实Notch1通路与GIC自我更新之间的直接关系。此外,我们的数据显示,自噬通过上调Notch1降解来抑制Notch1通路的活化。因此,自噬诱导的Notch1降解可能是阻止GBM进展的有前景的治疗策略。本课题主要研究自噬在GICs维持自我更新和致瘤性中的作用及其潜在机制,研究分为三个部分:1、CD133+的胶质瘤细胞的分离筛选和鉴定。为了研究GIC干性维持的机制,我们在体外建立了CD133+胶质瘤细胞模型:利用CD133免疫磁珠分选试剂盒(MACS)筛选得到CD133+的U87和U251胶质瘤细胞,用流式细胞术以量化MACS筛选的CD133+细胞以确认分选的有效性;选择CD133和Nestin作为标记以评估GIC干性;基于NICD和靶基因Hes1的表达来评估Notch1通路活化。通过星形细胞标志物,胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达来评估细胞分化。实验结果显示,MACS后CD133+的胶质瘤细胞阳性率较高;CD133+的胶质瘤细胞Nestin,CD133,Notch1,NICD呈阳性表达;CD133+细胞在干细胞培养基中培养并形成细胞球,而不根据CD133阳性分选的细胞在相同培养条件下不能发育出球体。2、抑制mTOR通路诱发自噬,降低GICs的自我更新能力。选择2种经典的mTOR通路抑制剂AZD8055和Rapamycin,检测其对GIC存活率的影响。通过Western Blot和免疫荧光染色,检测GIC经AZD8055和Rapamycin处理后mTOR通路相关蛋白mTOR,p-mTOR,Akt,p-Akt和自噬相关蛋白p62,LC3B的表达情况。经AZD8055和Rapamycin处理后,通过极限稀释实验、成球实验、增殖实验,检测GIC自我更新和增殖能力;使用AZD8055+3-MA组合来证实自噬对GIC自我更新的直接抑制;并通过Western Blot和免疫荧光染色检测干性相关蛋白Nestin,CD133和分化蛋白GFAP的表达情况。实验结果显示,用不同浓度的AZD8055和rapamycin处理不同的时间,GIC细胞活力降低;AZD8055和rapamycin可以抑制mTOR通路并诱发自噬,Nestin和CD133表达降低,GFAP表达增高,且各浓度组之间的蛋白表达差异均有统计学意义(均P0.05)。随药物浓度增高,GIC自我更新能力随之下降;GIC各组成球数目和细胞球体积递减。加药后,GIC增殖能力降低;上述结果差异均有统计学意义(P0.05)。3、自噬抑制Notch1通路的活化及GIC的致瘤性。首先检测自噬对Notch1通路表达的影响。经AZD8055和Rapamycin处理后,Notch1通路相关蛋白Notch1,NICD,Hes1的表达被检测。实验结果提示,Notch1通路相关蛋白的表达随药物浓度增高而降低,且各浓度组蛋白表达差异有统计学意义(P0.05)。进一步的研究表明,自噬调节Notch1的降解。经AZD8055和Rapamycin处理后,用Western Blot检测GIC的胞膜Notch1的表达情况。用免疫荧光染色检测胞内Notch1和LC3B的共定位情况。实验结果显示,GIC胞膜Notch1表达降低,Dll1表达不变,差异均有统计学意义(P0.05)。在GIC中Notch1和LC3B在胞内存在共定位关系。进一步,为了研究AZD8055和rapamycin对GIC致瘤性的潜在作用,U87GICs被植入脑中产生颅内原位异种移植模型。种植7天后,每周五天腹膜内注射DMSO,AZD8055或rapamycin持续3周。生物发光成像和HE染色显示,AZD8055和rapamycin组的GIC致瘤性低于DMSO组;特别是经AZD8055治疗比rapamycin治疗肿瘤体积更小。AZD8055和rapamycin处理的小鼠比DMSO处理的小鼠存活时间更长,其中经AZD8055处理的小鼠在组群中具有更长的存活期。这些结果表明AZD8055和rapamycin诱导的自噬抑制了体内U87 GICs的致瘤性。结论:1.抑制mTOR通路能够诱发自噬,并降低GICs的自我更新能力;2.自噬抑制Notch1通路的活化;3.自噬对Notch1通路活性的抑制是通过自噬囊泡吞噬并降解Notch1发生的;4.在体内实验中发现诱发自噬可以抑制GICs的致瘤性。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R739.41
【图文】：

离心管,免疫荧光染色,干细胞,实验室

图 1.1 如图所示：一种干细胞球的免疫荧光染色装置，左侧包括 1.5mL 的 EP (eppendorf) 管2，所述 1.5mL EP 管 2 是实验室常用的离心管，由塑料制成。包括修剪后的 200μL 离心管 1，将所述 200μL 离心管 1 管盖沿着边缘裁剪，使其能够放入 1.5mL EP 管 2 中。还包括一个泡沫塞 3，用于在 1.5mL EP 管 2 中填补空隙。1.1.3.6.2 实验步骤（1）收集细胞球于 15mL 的离心管中；（2）加入 1mL PBS,用 200μL 量程的移液枪轻轻的吹打细胞球后离心，离心速度为 800g/min，离心 5 分钟，去上清；（3）重复 b 步骤两次，去除干细胞培养基对细胞球的影响；（4）加入 1mL 4%的多聚甲醛，重悬细胞球 10 分钟，每隔 3 分钟用 200μL 量程的移液枪轻轻的吹打细胞球，以求细胞球与 4%的多聚甲醛充分接触；（5）加入 1mL 0.4%的 Triton X-100 通透细胞，后重复步骤 d；（6）重复 b 步骤两次，去除干细胞培养基对细胞球的影响；

免疫磁珠,干性,细胞,标志物

图 1.2 免疫磁珠筛选（MACS）CD133+的胶质瘤细胞并形成细胞球。A. 流式细胞术以量化MACS +群体中的 CD133 +细胞，检测 CD133+细胞百分比，筛选前后 U87 细胞系中 CD133+细胞百分比分别为 6.65±0.6％和 87.64±4.09％，U251 细胞系为 5.98±0.93％和 76.93±3.59％。B. CD133 +细胞在干细胞培养基中培养 7 天并形成悬浮细胞球，未在 CD133 阳性的基础上分选的细胞在相同培养条件下不能培养出细胞球。1.2.2 Western Blot 检测 CD133+细胞蛋白表达为了进一步证实筛选 CD133+细胞的干性表型，我们采用 Western Blot 检测CD133 和 Nestin 作为标记以评估；并基于 NICD 和靶基因 Hes1 的表达来评估Notch1 通路的活化；通过星形胶质细胞标志物，胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达来评估细胞分化。Western Blot 结果显示，CD133 +神经球的干细胞标志物（CD133 和 Nestin），Notch1 和活化的 Notch1 通路相关蛋白（NICD 和 Hes1）的表达高于 MACS 筛选前的细胞；此外，CD133 +神经球中 GFAP 的表达减少（图 1.3）。这些结果显示体外培养的 CD133+细胞球富集 GIC 并维持其干性表

蛋白表达,干性,细胞系

stern Blot 检测 CD133+细胞蛋白表达。CD133+的 U87 和 U251 细胞系细铁壁生长的普通细胞，高表达干性标志物 CD133 和 Nestin，低表达且伴 Notch1 通路高度活化（NICD 和 Hes1）。GAPDH 为内参。疫荧光染色检测 CD133+细胞蛋白表达部分实验中，在蛋白水平上，我们进一步用免疫荧光染色确定表达的结果，对 CD133+的 U87 和 U251 细胞系细胞球进行免发现，CD133+细胞球高表达 CD133，Nestin，Notch1 和 NIC CD133+的胶质瘤细胞能够维持自身干性表型，并伴 Notch1

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