鸟苷酸结合蛋白1促进胶质瘤进展的机制研究

发布时间：2020-08-25 03:56

【摘要】：【目的】鸟苷酸结合蛋白1(GBP1)为γ-干扰素(IFN-γ)等诱导的大GTP酶,广泛表达于全身各个器官细胞,在抗病原微生物等多种生物学反应中起重要作用。近期的研究发现GBP1参与肿瘤的发生发展、侵袭、转移等过程,但分子机制尚不明确,在不同肿瘤中的作用也存在差异。我们的前期研究发现,GBP1可促进人胶质瘤细胞在裸小鼠体内的增殖,但在体外的增殖未见明显变化。本研究旨在探讨GBP1促进胶质瘤增殖的机制。【方法】1.从Rembrandt数据库中查询人脑胶质瘤组织中GBP1表达与胶质瘤患者生存期的关系,GBP1表达与CCL2表达的关系。2.采用逆转录病毒载体,在胶质瘤细胞U87中过表达GBP1,建立过表达细胞U87-GBP1,对照细胞为U87-LacZ;采用慢病毒载体敲低胶质瘤细胞LN229中GBP1表达,建立低表达细胞LN229-shGBP1,对照细胞为LN229-shN。收集细胞提取RNA和蛋白质,qRT-PCR、Western blot分析细胞中GBP1的mRNA和蛋白质表达,确定过表达或低表达成功。收集细胞培养液于-70℃冰箱中冻存。3.CCK-8分析细胞体外生长变化。4.qRT-PCR和ELISA方法分别检测胶质瘤细胞和细胞培养上清中趋化因子CCL2的mRNA和蛋白质表达。5.Ficoll分离液分离人外周血单个核细胞(PBMCs),收集其中贴壁培养细胞(主要为单核细胞),用胶质瘤细胞培养液处理单核细胞2d,采用流式细胞术分析人髓源性抑制细胞(MDSCs,即CD11b~+HLA-DR~-细胞)的比例。6.用含抗人CCL2抗体的培养液培养U87-GBP1和LN229-shN细胞,收集培养液处理单核细胞,同上方法分析MDSCs比例。7.分别将5*10~5/10μL U87-GBP1和U87-LacZ细胞接种于Bal B/C裸小鼠颅内致瘤,40d后处死小鼠。分离小鼠移植瘤组织、骨髓和脾脏组织,通过流式细胞仪分析其中小鼠CD11b~+Gr-1~+(MDSCs)比例。【结果】1.数据库查询结果显示,人脑胶质瘤组织中GBP1表达与胶质瘤患者生存期呈负相关,与CCL2表达正相关。2.qRT-PCR、Western blot分析过表达或低表达GBP1的胶质瘤细胞中GBP1的mRNA和蛋白质表达变化,结果显示U87-GBP1细胞中GBP1表达显著高于对照细胞U87-LacZ,LN229-shGBP1中的GBP1表达明显低于LN229-shN细胞,表明成功建立过表达和低表达GBP1细胞。3.采用CCK-8方法测定细胞增殖变化。与对照细胞相比,过表达GBP1后U87-GBP1细胞增殖未见明显变化,低表达GBP1后LN229-shGBP1细胞增殖也未见显著变化。4.过表达GBP1后,U87-GBP1细胞中CCL2因子的mRNA表达和细胞培养液中CCL2的蛋白表达均明显升高;低表达GBP1后LN229-shGBP1细胞和细胞培养液中CCL2表达降低。5.用胶质瘤细胞培养液处理人单核细胞后MDSCs比例发生明显变化,其中U87-GBP1细胞组高于对照细胞U87-LacZ,LN229-shGBP1细胞组低于LN229-shN细胞。6.用含抗人CCL2抗体的培养液培养U87-GBP1和LN229-shN细胞,收集培养液处理单核细胞,流式细胞术测得其中MDSCs比例均降低。7.将U87-GBP1和U87-LacZ细胞接种于裸小鼠颅内致瘤,荷U87-GBP1小鼠移植瘤明显大于荷U87-LacZ小鼠,荷U87-GBP1小鼠移植瘤、骨髓和脾脏中MDSCs比例均高于荷U87-LacZ小鼠(P0.05)。【结论】1.过表达GBP1或低表达GBP1未对人脑胶质瘤细胞U87和LN229的体外增殖产生影响。2.胶质瘤患者组织中GBP1与CCL2表达具正相关性;GBP1可促进胶质瘤细胞中趋化因子CCL2的表达。3.胶质瘤细胞可在体外诱导人正常单核细胞获得MDSCs表型,而通过分泌CCL2作用于单核细胞或许是其中的机制之一。4.小鼠体内实验结果提示,GBP1可能通过诱导肿瘤微环境中MDSCs增加形成免疫抑制微环境,进而促进肿瘤的增殖。
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R739.41
【图文】：

示意图,脑胶质瘤,示意图,部分相互作用

而肿瘤局部产生的趋化因子和生长因子等可以与细胞外基质部分相互作用，使浸润的免疫细胞重新获得不同的功能表型，从而引导免疫系统发生炎症或抗炎反应。图. 脑胶质瘤免疫微环境示意图[24]。

数据库检索,过表达

稳定过表达或低表达 GBP1 的胶质瘤细胞CR 和 Western blot 检测胶质瘤细胞 U87、LN229 中 GBP1 中表达较低，LN229 表达较高。采用逆转录病毒载体在 U8过表达细胞 U87-GBP1 中 GBP1 的 mRNA 和蛋白表达明cZ（图 2A）。采用慢转录病毒载体干扰 LN229 细胞中 GBP1229-shGBP1 中 GBP1 mRNA 和蛋白表达明显低于对照组表明成功建立了稳定过表达或低表达 GBP1 的胶质瘤细胞P1。 1. Rembrandt 数据库检索结果。A. 与正常脑组织相比，人脑胶质织中 GBP1 表达升高；B. 高表达 GBP1 的胶质瘤患者生存期低于低 GBP1 的患者；C. 胶质瘤组织中 GBP1 与 CCL2 表达具正相关。

细胞,体外增殖,蛋白,过表达

表达或低表达 GBP1 的胶质瘤细胞体外增殖未见明显变化 CCK-8 试剂检测过表达或敲低 GBP1 表达的 U87 和 LN229 细胞在结果显示，与对照细胞 U87-LacZ 或 LN229-shN 相比，U87hGBP1 细胞在体外增殖未发生明显变化，几乎呈现出一致的变化趋P1 的表达变化对 U87 和 LN229 细胞的体外增殖未产生显著影响。 2. qPCR 和 Western blot 检测胶质瘤细胞 U87 和 LN229 中 GBP1 表达。A. 胞中转染 GBP1 基因后 U87-GBP1 细胞中 GBP1 mRNA（左）和蛋白（右）高于对照细胞 U87-LacZ。B. 敲低 LN229 细胞中 GBP1 后，LN229-shGBP中 GBP1 mRNA（左）和蛋白（右）表达低于对照细胞 LN229-shN。

【参考文献】