外泌体在肌肉萎缩症中的诊疗作用研究

发布时间：2020-08-31 19:48

　　目的:肌肉萎缩症是一类致死性遗传疾病,其中,临床上较为常见的一类肌肉萎缩症为杜兴肌肉萎缩症(Duchenne Muscular Dystrophy-DMD),是由DMD基因发生移码突变导致其编码的功能性dystrophin蛋白缺失所引起。临床表现为进行性肌肉萎缩及认知能力下降,是一类神经肌肉失调症。另外一类较为常见的肌肉萎缩症为dysferlin肌病,其临床表征异质性较高,是由于编码跨膜蛋白dysferlin蛋白的DYSF基因发生突变,导致dysferlin蛋白表达下调而引起的一种肌肉萎缩症,其发病时间较晚。临床上针对肌肉萎缩症的诊断,主要依赖于肌肉组织活检,但该方法是一种侵入性强的诊断方法,对病人造成精神和身体上的伤害较大,因此,新型非侵入式的诊断策略研发迫在眉睫。同时临床上对肌肉萎缩症还缺乏行之有效的治疗方法,亟需研发新型、高效和安全的治疗手段和策略。近年来,外泌体(exosome)作为一种细胞分泌的天然生物纳米级囊泡结构,其所具有的低免疫原性、来源广泛和结构稳定等重要特性,尤其是exosome可携带源细胞来源的蛋白、脂类、m RNA和micro RNA等多种信息,因此可作为细胞信使,在疾病诊断与治疗中显示出巨大的应用潜力。基于此,在本研究中,拟探究exosome在肌肉萎缩症诊疗中的应用可行性和潜力,以期为肌肉萎缩症诊治提供一种新方法和策略。方法:从健康人和dysferlin肌病患者的血清和尿液中,利用超速离心的方法提取exosome,并利用电镜、纳米检测仪和Western blot进行形态和表达谱鉴定。利用Western blot检测并比较健康人和患者血清及尿液来源exosome中dysferlin蛋白的表达水平,以探究携带dysferlin的exosome是否可用于dysferlin肌病的诊断。利用ELISA检测并比较血清和尿液来源exosome中dysferlin表达,以建立该方法的临床诊断标准。利用Western blot检测其他类型肌肉萎缩症患者血清及尿液来源exosome携带相关功能蛋白的表达水平,以探究exosome在其他肌肉萎缩症诊断的可行性。为探究exosome对肌肉萎缩症的治疗作用,分别在dysferlin肌病和DMD肌肉萎缩症模型上进行了系统测试。在dysferlin肌病测试中,利用Western blot对不同细胞来源的exosome进行dysferlin表达鉴定,筛选高负载dysfelrin蛋白的exosome(EXOdysf)。利用激光扫描共聚焦显微镜检测PKH67标记的exosome在dysfelrin缺失细胞(DYSF-/-)内的定位情况,采用Western blot及免疫荧光染色方法检测exosome处理的细胞中dysferlin蛋白的表达及定位情况,以确认EXOdysf作为运输载体的可行性及效率。将EXOdysf与DYSF-/-细胞共孵育48小时,利用双光子激光扫描共聚焦显微镜对肌管膜进行损伤,以测试EXOdysf对DYSF-/-细胞膜损伤修复的作用;利用免疫荧光染色检测受损DYSF-/-细胞膜表面溶酶体标志性蛋白LAMP-1的表达,以确定EXOdysf是否通过恢复dysferlin蛋白表达,从而促进溶酶体在细胞膜损伤修复过程中的作用;通过对细胞损伤修复过程荧光探针Fluo-3 AM标记的Ca2+流的变化,以探究EXOdysf是否可以调节膜损伤后Ca2+稳态。利用CRISPR-Cas9基因组编辑系统,对人DYSF基因外显子22和55进行缺失突变,获得dysferlin蛋白表达缺失的人细胞模型;将人血清来源exosome(EXOser)与dysferlin蛋白表达缺失细胞共孵育,利用Western blot检测dysferlin蛋白的传递及表达;通过膜损伤修复试验检测血清来源exosome在人源细胞模型上对膜损伤修复的作用。在DMD模型的测试中,利用DMD疾病模型mdx小鼠,收集不同细胞来源exosome,按150μg/只exosome剂量,以腹腔注射的方式,每周注射两次,连续注射3周。通过小鼠抓力的测试、血清肌酸激酶(CK)等方法来检测肌肉功能是否得到改善。利用体重变化的监测、肝脏和肾脏生化指标评估其安全性。利用HE肌肉病理切片染色、炎症细胞标志性蛋白的免疫组织化学染色以及炎症因子RT-PCR定量分析检测肌肉组织病理上的改善情况。利用血清免疫球蛋白(Ig G)染色来探究肌细胞膜完整性的改变;利用Western blot检测肌肉再生与分化相关的标志性蛋白的表达,以探究exosome对肌肉再生与分化功能的影响,并利用CTX急性损伤模型进行确认。通过Western blot和免疫荧光染色检测dystrophin相关蛋白复合体的表达及定位,以探究exosome对dystrophin蛋白相关功能蛋白复合体的恢复情况。针对dystrophin蛋白功能复合体的表达恢复及正确定位,利用Western blot、RT-PCR和免疫荧光染色分别从蛋白转运、m RNA水平改变、糖基化转移酶表达水平以及胞内蛋白酶体的表达及活性进行检测,以阐释exosome改善损伤肌肉功能的机制。结果:1.发现dysferlin肌病患者与健康人血清及尿液来源exosome上dysferlin蛋白表达呈现显著性差异,证明血清及尿液来源exosome上dysferlin蛋白表达差异可作为dysferlin肌病的诊断指标;并建立了检测血清exosome上dysferlin蛋白表达的ELISA方法,确立了其可用于dysferlin肌病临床诊断范围。2.通过对其他肌肉萎缩症患者血清及尿液来源exosome上相关功能蛋白的检测,为exosome用于相关疾病的临床诊断提供了证据。3.对不同细胞来源exosome中dysferlin蛋白表达水平测试,发现H2K肌管来源exosome(EXOdysf)上dysferlin蛋白表达水平较高。进而对EXOdysf的标志蛋白表达、形态、大小表征及膜上的定位研究结果表明:EXOdysf表达exosome的标志蛋白CD63、Alix和CD9,呈现为茶托状的纳米级囊泡结构;dysferlin蛋白定位在exosome的膜及细胞质内。通过EXOdysf在DYSF-/-细胞中摄取和细胞内定位试验,结果表明:EXOdysf可高效地将所负载的dysferlin蛋白输送到细胞内,并在细胞膜上正确定位,显示出exosome可作为膜蛋白运输载体的潜力。在DYSF-/-细胞模型上,对EXOdysf修复肌细胞膜损伤能力的测试,结果表明:EXOdysf通过恢复DYSF-/-细胞中dysferlin蛋白的表达,进而改善细胞膜损伤修复能力及溶酶体在膜损伤修复中的作用,并进一步调节肌肉细胞中Ca2+稳态。在此基础上,利用CRISPR-Cas9基因组编辑系统,成功获得了人DYSF基因外显子22和55缺失突变的人源dysferlin蛋白缺失细胞模型。在两个细胞模型上,通过测试人血清来源exosome(EXOser)对dysferlin蛋白缺失的人肌肉细胞膜损伤修复作用,结果表明:EXOser可高效介导dysferlin蛋白运输及dysferlin蛋白缺失的人肌肉细胞膜损伤修复作用,并且EXOser适用于不同突变类型,具有普适性。4.在mdx小鼠模型上对不同细胞来源exosome系统测试结果显示,不同细胞来源exosome均可显著提高mdx小鼠抓力、显著降低血清CK值,说明exosome能够改善mdx小鼠肌肉功能。血生化分析结果显示:与未治疗组相比,治疗组中肝脏和肾脏功能相关的生化指标无显著性变化;在治疗过程中,小鼠体重无明显变化,说明exosome未表现出相关毒性。对exosomes治疗的mdx小鼠中,不同肌肉病理检测结果表明:exosome能够改善肌纤维降解与坏死,降低炎症因子表达,抑制炎症细胞浸润。通过检测肌肉膜上血清免疫球蛋白的表达水平,发现exosome治疗后肌肉膜上血清免疫球蛋白表达降低,说明exosome可改善肌细胞膜的完整性。在mdx及CTX急性损伤小鼠模型中,对exosome治疗后肌肉肌纤维再生与分化相关蛋白的检测结果发现:exosome能够促进损伤肌肉的再生与分化;并且提高mdx小鼠肌肉中dystrophin相关功能蛋白复合体中dystroglycan和sarcoglycan蛋白表达及在肌肉膜上的正确定位。对其作用机制的研究结果表明:exosome可能通过抑制蛋白酶体的表达和活性,从而稳定和提高mdx小鼠肌肉中dystrophin相关功能蛋白复合体表达和正确定位。结论:1.人血清和尿液来源的exosome可作为dysferlin肌病及其他相关肌肉萎缩症新型的低/非侵入性诊断手段,为dysferlin肌病及其他相关肌肉萎缩症临床诊断提供了新工具。2.Exosome可作为膜蛋白的有效运输载体,介导dysferlin蛋白的运输和正确定位,并改善细胞膜损伤修复及膜内钙离子稳态的作用,为dysferlin肌病提供一种新治疗策略和模式。3.Exosome可提高mdx小鼠肌肉功能,改善肌纤维膜的稳定性和肌肉炎症状态,促进肌纤维再生与分化,为DMD治疗提供了一种新治疗思路和模式。4.在mdx小鼠上,对exosome作用机制的初步研究表明:exosome可能通过抑制蛋白酶体表达和活性,从而稳定骨骼肌及心肌中dystrophin相关蛋白复合体表达及其肌肉膜上的正确定位。
【学位单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R746.4
【部分图文】：

示意图,蛋白结构,示意图,治疗研究

图 1 dysferlin 和 dystrophin 蛋白结构示意图[7]二、Dysferlin 肌病治疗研究概况目前，临床上对 dysferlin 肌病缺乏有效的治疗方法。尽管对 dysferlin 肌病的治疗研究已经开展，但是相对其他肌肉萎缩症而言，对 dysferlin 肌病的治疗研究还处于早期的阶段。近年来，基因治疗在肌肉萎缩疾病的治疗中得到广泛的关注和应用。研究表明，若在 dysferlin 肌病动物模型鼠体内转入 dysferlin 基因的功能区域片段，该片段可表达出较全长 dysferlin 蛋白更短的但具有一定功能的 dysferlin 蛋白，并且表达的新 dysferlin 蛋白成功修复了损伤的肌细胞膜，但并未有效改善小鼠进行性的肌肉萎缩，提示了全长 dysferlin 蛋白对改善疾病发展进程的重要性[12, 13]。在基因治疗的手段中，病毒常被用作基因的运输载体然而由于病毒载体的容载量有限，全长 DYSF 基因的体内运输仍是一项很大的挑战。尽管目前已有利用腺相关病毒（AAV）载体运输全长或迷你 dysferlin 基因在非人模型上进行了功能测试[14, 15]，但 AAV 载体在体内所引起的免疫原性问题限制了其在重复治疗中的效果。法国 Bartoli 研究小组基于临床病例，发现含有

结构示意图,淀粉样前体蛋白,模型小鼠,神经毒性

天津医科大学博士学位论文36-38]。值得一提的是，研究显示，通过向表达淀粉样前体蛋白沉淀模型小鼠脑内注射负载淀粉酶的 exosome，可以有效地清除目的减少脑内淀粉样蛋白沉积及其介导的神经毒性[39]。这些研究结果me 作为蛋白运输载体在疾病治疗中的应用潜力。研究表明，C2C12

来源,透射电子显微镜,标尺,形态

图 1 人血清来源 exosome 表征及 dysferlin 蛋白表达检测（a）透射电子显微镜鉴定 EXOser 的形态与大小，标尺=100nm。（b）纳米颗粒追踪分析仪（NTA）检测 EXOser 的粒径大小分布（c）EXOser 蛋白表征检测：exosome 标志性蛋白检测和 dysferlin 表达丰度检测。EXOdysf 为肌管来源exosome。1.2.2 人血清来源 exosome 在 dysferlin 疾病诊断中的研究为了探究血清来源 exosome 上的 dysferlin 蛋白表达是否可以达到区别健康人和 dysferlin 肌病患者的目的，首先我们收集了 3 例 dysferlin 肌病患者的血清并提取 exosome，将健康人血清来源 exosome 作为对照，利用 western blotting 检测病人血清来源exosome中dysferlin蛋白的表达水平。结果显示：在3例dysferlin肌病患者血清来源的 exosome 中均未检测到 dysferlin 蛋白的表达，而在对照exosome 中，可以检测到清晰的 dysferlin 蛋白表达条带（图 2 a）。由此表明，利用血清 exosome 中 dysferlin 蛋白的表达可以区别健康人和患者。

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