血管生长因子Aggf1对大鼠蛛网膜下腔出血后脑损伤的保护作用及其机制研究

发布时间：2020-09-01 20:06

　　第一部分:内源性Aggf1在大鼠SAH后的表达目的:探讨内源性的血管生长因子Aggf1在大鼠蛛网膜下腔出血(spontaneous subarachnoid hemorrhage,SAH)后的表达变化。方法:采用动脉穿刺法建立Sprague-Dawley(SD)大鼠SAH模型,并分别在SAH后3 h、6 h、12 h、24 h、72 h断头收集出血侧大脑皮质,用免疫印迹蛋白法(Western blot)检测内源性Aggf1的表达;此外,在SAH后24 h断头取出出血侧大脑皮质,用免疫荧光(immunofluorescence)分别检测Aggf1在神经元、小胶质细胞、星形胶质细胞和血管内皮细胞的表达。结果:与对照组比较,Western blot结果显示内源性Aggf1在SAH后24 h显著增加,并且在72 h达到高峰;免疫荧光结果显示内源性Aggf1主要与血管内皮细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞的标志物共染。结论:SAH引起内源性Aggf1表达增加,此蛋白主要表达于血管内皮细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞。第二部分:外源性rh-Aggf1对SAH后脑损伤和炎症的作用目的:探讨外源性人重组蛋白Aggf1(rh-Aggf1)对SAH后神经功能、脑水含量、血脑屏障通透性、神经炎症的影响方法:建立SD大鼠SAH模型,模型建立后1 h,经尾静脉注射rh-Aggf1;此外,在SAH模型建立前48 h经侧脑室注射Aggf1 si RNA抑制内源性Aggf1的表达。在SAH后24 h采用改良Garcia评分方法和改良Beam Balance评分方法评估大鼠神经功能状况;在SAH后7 d,14 d,21 d,采用步错实验(Foot Fault Test)评估大鼠运动和感觉功能;在SAH后21-25 d,采用水迷宫实验(Morris Water Maze,MWM)评估大鼠长期的空间记忆功能;评估SAH模型出血评分;用干湿法检测双侧大脑半球脑水含量;用伊文思蓝(Evans Blue,EB)渗透量检测血脑屏障(Blood Brain Barrier,BBB)的通透性;用Immunofluorescence标记髓过氧化物酶(Myeloperoxidase,MPO)检测中性粒细胞的浸润;用Western blot检测TNF-α和IL-1β表达量。结果:SAH导致改良Garcia和改良Beam Balance分数降低、脑水含量升高、Evans Blue渗透率增加,促进中性粒细胞浸润浸润和TNF-α、IL-1β表达。然而,给予rh-Aggf1治疗能显著地降低神经功能评分、脑水含量和Evans Blue渗透量,并能抑制中性粒细胞的浸润和TNF-α、IL-1β的表达。相反,抑制内源性Aggf1表达,加重了脑损伤和神经炎症。此外,在Foot Fault Test中,SAH后大鼠前肢步错次数增多,而rh-Aggf1治疗能明显改善大鼠运动协调能力;在Water Maze Test中,SAH后大鼠发现平台的时间和距离延长,而rh-Aggf1治疗后,大鼠的学习记忆功能显著改善。结论:外源性rh-Aggf1能改善大鼠SAH后神经功能障碍和长期运动协调、记忆功能缺损,降低脑水肿和血脑屏障的通透性,抑制中性粒细胞的浸润,下调炎症因子的释放,从而抑制炎症反应。然而,抑制内源性Aggf1加重了脑损伤和神经炎症。第三部分Aggf1通过PI3K/Akt/NF-κB信号通路发挥神经保护作用目的:探讨外源性rh-Aggf1对大鼠SAH后脑损伤的保护机制是否与PI3K/Akt/NF-κB信号通路有关。方法:参照第二部分。在大鼠SAH模型建立前30 min,经侧脑室注射PI3K特异性抑制剂LY293002;在SAH模型建立后1 h,经尾静脉注射rh-Aggf1。在模型建立后24h,用改良Garcia评分方法和改良Beam Balance评分方法评估大鼠神经功能状况;用干湿法检测双侧大脑半球脑水含量;用Western blot检测Albumin、MPO、PI3K、p-Akt、Akt、VE-cadherin、Occludin、Claudin-5、p-NF-κB p65、NF-κB p65、TNF-α、和IL-1β的表达。结果:LY294002预处理能显著逆转rh-Aggf1治疗在神经功能、脑水肿的作用;Western blot结果显示LY294002明显逆转rh-Aggf1治疗后Albumin渗透和MPO表达。与Vehicle组相比,外源性rh-Aggf1能明显增加PI3K、p-Akt、VE-cadherin、Occludin、Claudin-5的表达,降低p-NF-κB p65、NF-κB p65、TNF-α、和IL-1β的表达;而LY294002能明显抵消rh-Aggf1治疗后的下游分子改变。结论:在大鼠SAH后,外源性rh-Aggf1治疗能减轻BBB破坏、神经炎症的发生,从而改善神经功能缺损,其神经保护功能至少部分与PI3K/Akt/NF-κB信号通路的激活有关。
【学位单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R743.35
【部分图文】：

后脑,内源性

Sham SAH图 1.1 Sham 组与 SAH 组大体标本。Figure 1.1 Representative images in sham and SAH groups.2.2 内源性 Aggf1 在 SAH 后脑组织的表达变化Western blot 结果显示，相比于 Sham 组，SAH 后 24 h, Aggf1的表达明显增加，并且在 72 h 达到峰值（图 1.2）。

脑组织,后脑

Sham SAH.1 Sham 组与 SAH 组大体标本。re 1.1 Representative images in sham and SAH groups.性 Aggf1 在 SAH 后脑组织的表达变化tern blot 结果显示，相比于 Sham 组，SAH 后 24 h, Ag显增加，并且在 72 h 达到峰值（图 1.2）。

细胞定位

图1.3 SAH后Aggf1的细胞定位。上图显示免疫荧光所选区域；下图显示Ag要表达于星形胶质细胞（GFAP）、血管内皮细胞（vWF）和小胶质细胞（Iba-=3, Scale bar=50μm。Figure 1.3 The expression of Aggf1 in neuron, Astrocyte, Endothelium icroglia. Upper panel indicates the location of staining in the brain (small black boolocalization of Aggf1 with Astrocyte (GFAP), Endothelium (vWF, green) icroglia (Iba-1) at 24 h after SAH. Nuclei are stained with DAPI (blue). n=3 per grcale bar=50μm.3 讨论本实验首先在动物呼吸机辅助通气下，经颈内动脉穿刺建立 SAH 模型，实果显示本实验穿刺模型大鼠出血量相对而言比较稳定，血凝块主要集聚在颞底皮层（Willis 动脉环区，与临床 SAH 具有很大的相似性，具有一定的研究

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