新型运输辅助剂GF对肽-PMO在杜兴肌肉萎缩症小鼠上的作用研究

发布时间：2017-04-01 18:00

  本文关键词：新型运输辅助剂GF对肽-PMO在杜兴肌肉萎缩症小鼠上的作用研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:杜兴肌肉萎缩症(Duchenne muscular dystrophy-DMD)是一种X染色体连锁遗传的致死性神经肌肉失调症。DMD的致病原因为抗肌萎缩蛋白(dystrophin)的基因发生突变,使得功能性dystrophin蛋白缺失。目前,在临床上未见任何有效的治疗。反义寡核苷酸(Antisense Oligonucleotides-AO)介导的外显子跳读疗法是研究最为广泛的一种治疗方法,已经在III期临床试验。但最近的报道显示临床测试的药物系统运输效率低,临床试验结果未达到预期。因此,研发安全高效的药物运输辅助剂,以提高AO药物在全身肌肉中的运输效率,对于DMD的外显子跳读治疗乃至其他疾病的治疗显得尤为重要。针对这一关键科学问题,我们研发了一种新型药物运输辅助剂GF(2.5%glucose:2.5%fructose),在前期研究工作中发现:GF能显著促进mdx小鼠全身骨骼肌内反义寡核苷酸药物PMO的摄取及活性,但在心肌中未检测到dystrophin蛋白的表达。而心肌衰竭是限制DMD患者寿命的重要因素,是DMD治疗中需攻克的难题之一。为检测GF对mdx小鼠心肌和平滑肌的作用效果,本研究利用课题组前期研发的一系列能够在mdx小鼠体内发挥高效作用的肽修饰的PMO(Peptide-PMO,PPMO)类药物,在mdx小鼠上系统测试GF与不同肽-PMO在不同剂量下,对mdx小鼠心肌及平滑肌的作用。本研究分别测试了三类肽-PMO药物,包括R-PMO、Pip5e-PMO和B-MSP-PMO,这些AO药物能够高效诱导mdx心肌中dystrophin蛋白表达。通过将这三类药物分别与GF在mdx小鼠体内展开系统研究,旨在测试GF能否增强AO药物在mdx心肌和平滑肌中的运输效率。方法:1.药物注射途径和剂量:本研究通过小鼠尾静脉系统将生理盐水或GF辅助的反义寡核苷酸药物注射入6至8周龄的成年mdx小鼠体内,所有动物实验均为单次尾静脉注射。药物剂量分别为:12.5mg/kg R-PMO两周后收样、25mg/kg R-PMO三周后收样、15mg/kg Pip5e-PMO一周后收样、20mg/kg Pip5e-PMO两天以及20mg/kg B-MSP-PMO两周后收样,其中20mg/kg Pip5e-PMO为lissamine荧光标记药物。在B-MSP-PMO系统试验中,包含GF诱导组,通过每周一次单独注射GF,持续注射4周,第5周再注射GF和B-MSP-PMO药物。2.样品收取:治疗结束后,利用眼眶取血法获取小鼠血液样品,并通过静置离心获得血清。利用液氮冷冻收取小鼠心肌、前胫骨肌等6种骨骼肌;小肠等3种平滑肌以及脑组织。利用包氏液固定肝肾组织。3.Pip5e-PMO药物组织分布情况检测:利用小动物活体成像技术(IVIS)检测荧光染料标记的20mg/kg Pip5e-PMO在mdx小鼠各组织内的分布情况,并定量分析以确定GF对Pip5e-PMO组织摄取效率的影响。4.IHC检测:利用免疫组化荧光染色来检测不同药物引起的dystrophin蛋白阳性肌纤维在各组织切片内的分布和强度,以确定GF对不同药物的增强作用。5.RNA水平上的检测:利用RT-PCR技术来检测RNA水平上不同AOs药物引起的外显子23跳读水平,以确定GF对不同药物在RNA水平上的跳读提高作用。6.蛋白水平上的检测:利用Western Blot技术来检测不同药物在各组织内恢复的dystrophin蛋白表达水平,以确定GF对不同药物在蛋白水平上的促进作用。7.肌肉功能恢复情况检测:通过免疫组化荧光染色确定dystrophin蛋白相关复合物(DAPC)各蛋白成分在肌纤维膜上的重新定位情况和血清中CK-MB水平以评估心脏功能恢复情况;利用DAPC染色、血清中肌酸激酶CK含量测定、HE染色统计骨骼肌中中心核纤维(centrally nucleated myofibers-CNF)比例、CD3和CD68组化染色确定胸膈肌中免疫炎症细胞数量以及抓力测试(grip strength)来评估骨骼肌功能改善程度。8.对B-MSP-PMO药物相关毒副作用检测:通过检测血糖水平,以确定药物注射对小鼠血糖浓度的影响;通过谷草转氨酶(AST)、肌酐(CREA)等血清学指标检测及HE染色等方法评估药物潜在的毒副作用。结果:1.Pip5e-PMO组织分布检测:小动物活体成像检测和定量分析结果显示,GF未能有效促进荧光标记的Pip5e-PMO在mdx各肌肉组织中的摄取。2.新型运输辅助剂GF对三种不同AOs药物在骨骼肌中的IHC检测结果显示:1)在12.5mg/kg的剂量下,R-PMO和GF共注射在骨骼肌中恢复的dystrophin阳性肌纤维数量接近正常水平,二组无明显差异;同样,在25mg/kg剂量下,两个不同处理组在骨骼肌中介导的阳性肌纤维表达接近100%,二者之间未检测到明显差异。2)在GF对Pip5e-PMO作用效果的研究中,在不同剂量和治疗周期下,Pip5e-PMO在骨骼肌中介导的dystrophin表达水平有差异。与20mg/kg Pip5e-PMO和GF共注射48h收样组相比,15mg/kg Pip5e-PMO与GF共注射1周收样组在骨骼肌中恢复的阳性肌纤维表达更高,但两组均无明显差异。3)在GF对B-MSP-PMO作用效果研究中,单次20mg/kg剂量下,三组在骨骼肌中均介导100%正常水平的dystrophin阳性肌纤维表达,且三组之间无明显差异。3.新型运输辅助剂GF对三种不同AO药物在平滑肌中的IHC检测结果显示:1)两种不同剂量的R-PMO介导小肠平滑肌中阳性肌纤维表达有限,且两组之间无明显差异;25mg/kg R-PMO在肺平滑肌中介导了一定数量的阳性肌纤维表达,两组无显著差异;R-PMO在25mg/kg的剂量下,在气管平滑肌中介导较多的阳性肌纤维表达,且GF组显著强于对照组。2)两种剂量的Pip5e-PMO均未能在平滑肌中介导明显的阳性肌纤维表达。3)20mg/kg B-MSP-PMO在平滑肌中介导数量较多的阳性肌纤维表达,三组在小肠和肺组织介导的阳性肌纤维表达无明显差异;但在气管平滑肌中,GF组和GF诱导组均高于生理盐水组。4.新型运输辅助剂GF对三种不同AO药物在心肌中的IHC检测结果显示:1)在高剂量下,R-PMO在心肌中恢复的阳性肌纤维数量明显增多,但两组间无明显差异。2)15mg/kg Pip5e-PMO一周收样组和20mg/kg Pip5e-PMO 48小时收样组在心肌中介导阳性肌纤维表达有限,且两组无差异。3)20mg/kg B-MSP-PMO在心肌中介导了较多的阳性肌纤维表达,且GF组和GF诱导组明显高于对照组。5.新型运输辅助剂GF对三种不同AO药物在骨骼肌中的RT-PCR检测结果显示:1)两种不同剂量R-PMO均在骨骼肌中介导高效的外显子跳读,跳读水平接近100%。2)15mg/kg和20mg/kg Pip5e-PMO在骨骼肌中分别介导平均水平在70%和90%的外显子跳读,但两组间无差异。3)20mg/kg B-MSP-PMO在骨骼肌中介导外显子23的完全跳读,且三组之间无显著差异。6.新型运输辅助剂GF对三种不同AO药物在平滑肌中的RT-PCR检测结果显示:1)高剂量R-PMO介导小肠平滑肌中的外显子跳读效率相比于低剂量明显升高,但在两种不同剂量下,GF组和对照组均无差异;在25mg/kg R-PMO注射的肺平滑肌中,GF组和生理盐水组均表现出有限的外显子跳读效率,二者之间无明显差别;但在气管平滑肌中,GF组跳读水平明显高于对照组。2)两种不同剂量的Pip5e-PMO在平滑肌中介导的外显子跳读水平都较低,生理盐水组与GF组之间均无差异。3)20mg/kg B-MSP-PMO在小肠和气管平滑肌中均能介导高效的外显子跳读,而在肺组织中的跳读水平相对较低。与生理盐水组相比,GF和GF诱导组在小肠和肺中无显著差异;但在气管中,GF组和GF诱导组跳读水平明显高于生理盐水组。7.新型运输辅助剂GF对三种不同AO药物在心肌中的RT-PCR检测结果显示:1)剂量的上升使R-PMO在心肌中介导的外显子跳读水平升高,但两组无明显差异。2)在15mg/kg和20mg/kg两种剂量下,GF在心肌中均未能提高Pip5e-PMO介导的外显子跳读水平。3)20mg/kg B-MSP-PMO在心肌中介导高效的外显子23跳读,且GF组和GF诱导组显著高于生理盐水组。8.新型运输辅助剂GF对三种不同AO药物在骨骼肌中的蛋白检测结果显示:1)12.5mg/kg R-PMO在骨骼肌中介导的dystrophin蛋白恢复水平约为70%,但生理盐水和GF组之间无差异;25mg/kg R-PMO在不同骨骼肌中都诱导接近100%正常水平的dystrophin蛋白表达。2)15mg/kg Pip5e-PMO一周收样处理组在骨骼肌中恢复的dystrophin表达水平约为50%,而20mg/kg Pip5e-PMO 48小时收样处理组约为10%。在两种剂量下,两组均无明显差异。3)20mg/kg B-MSP-PMO在骨骼肌中介导的dystrophin蛋白平均表达水平,在生理盐水组中约为60%,在GF组和GF诱导组中为80%左右,稍高于生理盐水组,但无显著性差异。9.新型运输辅助剂GF对R-PMO和B-MSP-PMO在平滑肌中的蛋白检测结果显示:1)12.5mg/kg R-PMO在小肠平滑肌中恢复dystrophin蛋白表达水平低于10%,而25mg/kg R-PMO处理组的dystrophin蛋白水平提高到20%以上,但两种剂量的生理盐水和GF组相比,均无差异;25mg/kg R-PMO在肺平滑肌中恢复dystrophin蛋白表达水平接近20%,二者之间无明显差异;在气管平滑肌中,GF显著提高R-PMO活性,生理盐水组蛋白水平仅为30%左右,而GF组则达到了50%以上。2)20mg/kg B-MSP-PMO在小肠和肺平滑肌中恢复dystrophin蛋白表达水平分别为正常水平的60%和20%,但三组间无明显差异;在气管平滑肌中,GF组dystrophin蛋白表达水平稍高于对照组,而GF诱导组则显著高于对照组。10.新型运输辅助剂GF对三种不同AO药物在心肌中的蛋白检测结果显示:1)12.5mg/kg R-PMO在心肌中恢复约20%的dystrophin蛋白表达,生理盐水和GF组之间无差异;25mg/kg R-PMO在心肌中恢复dystrophin蛋白表达水平为50%以上,GF组略高于生理盐水组,但无显著差异。2)15mg/kg Pip5e-PMO一周收样组在心肌中介导10%左右的dystrophin蛋白表达,20mg/kg Pip5e-PMO 48小时收样组dystrophin蛋白表达低于5%;但在两种剂量下,生理盐水和GF组均无明显差异。3)20mg/kg B-MSP-PMO在心肌中介导的dystrophin蛋白表达水平在GF和GF诱导组均高于80%,而生理盐水组为60%左右,GF和GF诱导组显著高于生理盐水组。11.B-MSP-PMO药物对mdx小鼠肌肉功能恢复情况检测分析:1)心肌IHC染色显示:dystrophin在心脏中的表达恢复,能够使DAPC各蛋白成分重新定位于心肌细胞膜上;血清学检测显示:肌酸激酶同工酶(CK-MB)水平低于未处理的对照小鼠,表明心肌细胞膜完整性有所提高。2)骨骼肌IHC染色显示:DAPC各蛋白成分重新定位于骨骼肌肌纤维膜上;血清中肌酸激酶(CK)水平低于未处理对照组,提示骨骼肌肌纤维膜完整性有所提高。对小鼠骨骼肌中的中心核肌纤维和免疫炎症细胞检测结果显示:与未处理组相比,B-MSP-PMO处理组中心核肌纤维和免疫炎症细胞数量显著降低,提示B-MSP-PMO能够改善mdx小鼠肌肉再生和免疫环境。肌肉抓力测试结果表明:B-MSP-PMO处理组显著高于未治疗对照小鼠,提示肌肉整体功能的提高。12.对B-MSP-PMO药物相关毒副作用检测结果显示:B-MSP-PMO与生理盐水或GF的共同注射未引起血糖浓度的明显波动;血清中肝功能标志物谷草转氨酶(AST)等以及肾功能标志物尿酸(UA)等水平无明显变化;HE染色显示肝、肾细胞形态未发生可见病变,提示药物治疗并未导致明显的毒副作用。结论:1.通过对新型运输辅助剂GF与三种不同肽-PMO药物在mdx小鼠上的系统测试,证明GF能增强肽-PMO类药物在不同肌肉组织中的活性。2.GF与R-PMO在mdx小鼠上的系统研究结果表明,在饱和剂量下,GF在骨骼肌中对PMO活性增强作用效果不明显,但显著提高了R-PMO在气管平滑肌中的作用效果。3.GF能够提高B-MSP-PMO在mdx小鼠骨骼肌和气管平滑肌中的活性;尤为重要的是,GF显著增强B-MSP-PMO在心肌中的活性。4.GF重复使用能够进一步提高核酸类药物的运输效率,且无明显毒副作用,证明GF具有一定的有效性和安全性。
【关键词】：杜兴肌肉萎缩症 运输辅助剂GF 肽-PMO 外显子跳读 抗肌萎缩蛋白
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R746.4
【目录】：

• 中文摘要4-9
• Abstract9-18
• 缩略语18-19
• 前言19-25
• 研究现状、成果19-24
• 研究目的、方法24-25
• 对象和方法25-38
• 1.1 实验材料25-27
• 1.1.1 实验动物25
• 1.1.2 测试反义寡核苷酸药物名称及序列25
• 1.1.3 主要仪器设备25-26
• 1.1.4 实验试剂26-27
• 1.1.5 引物27
• 1.1.6 主要分析工具软件27
• 1.2 实验方法27-38
• 1.2.1 试剂配制27-30
• 1.2.2 动物注射30-31
• 1.2.3 组织RNA的提取31
• 1.2.4 One Step RT-PCR31-32
• 1.2.5 PCR扩增32-33
• 1.2.6 组织免疫荧光染色-dystrophin染色33
• 1.2.7 组织免疫荧光染色-nNOs蛋白染色33
• 1.2.8 dystrophin相关蛋白复合体免疫荧光染色33-34
• 1.2.9 蛋白的提取34
• 1.2.10 蛋白浓度测定34-35
• 1.2.11 蛋白杂交检测35
• 1.2.12 病理检测-苏木精伊红染色35-36
• 1.2.13 血清检测36
• 1.2.14 抓力测试36
• 1.2.15 免疫炎症反应CD3~+T细胞和CD68~+巨噬细胞组织化学染色36-37
• 1.2.16 体内分布测试37
• 1.2.17 定量分析dystrophin蛋白表达水平37
• 1.2.18 数据分析37-38
• 结果38-58
• 2.1 GF与R-PMO在mdx小鼠上的研究38-45
• 2.1.1 GF与R-PMO对mdx小鼠心肌的作用效果测试38-39
• 2.1.2 GF与R-PMO对mdx小鼠平滑肌的作用效果测试39-43
• 2.1.3 GF与R-PMO对mdx小鼠骨骼肌的作用效果测试43-45
• 2.2 GF与Pip5e-PMO在mdx小鼠上的研究45-50
• 2.2.1 GF与Pip5e-PMO对mdx小鼠心肌的作用效果测试45-47
• 2.2.2 GF与Pip5e-PMO对mdx小鼠平滑肌的作用效果测试47-48
• 2.2.3 GF与Pip5e-PMO对mdx小鼠骨骼肌的作用效果测试48-50
• 2.3 GF与B-MSP-PMO-PMO在mdx小鼠上的研究50-58
• 2.3.1 GF与B-MSP-PMO对mdx小鼠心肌的作用效果测试51
• 2.3.2 GF与B-MSP-PMO对mdx小鼠平滑肌的作用效果测试51-54
• 2.3.3 GF与B-MSP-PMO对mdx小鼠骨骼肌的作用效果测试54-55
• 2.3.4 GF与B-MSP-PMO对mdx小鼠肌肉功能恢复效果测试55-56
• 2.3.5 GF与B-MSP-PMO对mdx小鼠药物相关毒副作用测试56-58
• 讨论58-61
• 结论61-62
• 参考文献62-67
• 发表论文和参加科研情况说明67-68
• 综述 DMD环境下的肌肉线粒体异常研究进展68-79
• 综述参考文献76-79
• 致谢79-80
• 个人简历80

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本文编号：281022