神经根炎大鼠自噬和凋亡及医用臭氧的干预作用研究

发布时间：2020-09-03 09:43

　　研究背景疼痛,作为第五大生命体征,越来越引起临床关注。而有效缓解或根除患者的疼痛自然成为一个关键。腰腿痛是目前最广泛的病症之一,多与椎间盘突出相关,有许多研究学者已经发现,神经根炎(Radiculitis)是导致顽固的根性疼痛祸首之一。研究和探讨神经根炎的致病机理和臭氧治疗的内在机制能为临床诊治提供新的理论依据以及潜在的作用靶点。神经根炎(Radiculitis)在临床上主要表现为神经束膜炎症或炎性浸润后的背根神经节和神经根炎症。神经根炎患者常出现电生理异常,神经传导减慢,广泛的轴突损伤等情况。引起神经根炎的原因及机制概括起来主要有以下几个方面。(1)机械性压迫(compression)产生神经根炎。大量研究表明,神经根无结缔组织保护鞘,对机械压迫较为敏感,压迫对神经根产生直接机械效应,并通过损害神经血供与营养而产生神经根炎。临床上腰椎间盘突出症,突出髓核压迫神经根,可造成神经根炎,引起患者肢体疼痛。(2)化学介质性神经根炎假说。腰椎间盘突出症中,突出的髓核和纤维环刺激,会引起肥大细胞出现在受损区域神经外膜和内膜以及神经囊膜,释放一些炎症介质如组胺,它们刺激神经根和窦椎神经,导致神经根中渗出大量炎性蛋白,增加了神经内压力,引起局部缺血和电解质紊乱,导致神经根炎,从而引起神经支配区的疼痛。其他物质如神经肽类在疼痛感受中也起重要作用,这些致痛物质直接激发疼痛和降低疼痛阈值。(3)自身免疫假说。有学者认为随着椎间盘老化或退变,髓核中基质降解酶增加,使糖蛋白及连接蛋白裂解为高度异质性分子,在退变纤维环出现裂隙后漏出来,产生自身免疫反应。退变椎间盘组织中免疫球蛋白的沉积、淋巴细胞和巨噬细胞的浸润可介导自体免疫反应引起椎间盘和神经根的损伤,但有关神经根痛的免疫反应机理尚需进一步研究。机械压迫学说中的压迫、化学性神经根炎学说中的炎症刺激及自身免疫学说中的免疫反应三者之间是互相促进互为调节的。机械性压迫,可使局部血管通透性增加,血管-神经屏障破坏,神经内水肿,神经内液压升高,进一步阻断血供,异常神经递质释放以及炎症反应,使神经根受刺激产生症状。同时神经根内炎症细胞和纤维细胞浸润,形成纤维疤痕,又会加重神经根的压迫。持续的化学刺激和炎症反应可以导致免疫反应的发生;在免疫反应的作用下,许多神经多肽可以释放出来,而又加重刺激和炎症。但有关神经根炎的致病机制还不够完善,有待进一步研究。自噬(autophagy)称为 Ⅱ 型程序性细胞死亡(type Ⅱ programmed cell death),是真核细胞特有的生命现象,维持蛋白代谢平衡及细胞内环境稳态。在真核物种调控细胞内物质代谢周转中起非常重要的作用。细胞自噬分为微自噬(microautophagy)、巨自噬(macroautophagy)和分子伴侣介导的自噬(Chaperone-mediated autophagy,CMA)三种类型。自噬发生时,染色质并不发生凝聚,Caspase(天冬氨酸半胱氨酸特异性蛋白酶)也并不参与该过程,然而,细胞质内出现大量双层膜结构的自噬体。自噬体包裹细胞质和受损细胞器,再与溶酶体融合,形成单层膜的自噬溶酶体,并借助溶酶体内水解酶的作用,分解内容物,所降解的物质可以被细胞再利用。自噬过程受到一组进化上保守的自噬相关基因(autophagy associated gene,ATG)的严格调控。细胞内自噬过度或自噬不足都可能引发人类疾病,例如肿瘤、衰老和神经退行性疾病等。凋亡即Ⅰ型程序性细胞死亡(type Ⅰ programmed cell death),是指由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞死亡过程,为程序性细胞死亡(programmed cell death,PCD)的形式之一,与生命体的生长发育,清除损伤和衰老的细胞,以及防止癌细胞的发生有着密切的关系,是细胞的一种基本生物学现象。机体在生理情况下通过凋亡清除衰老或多余的细胞,凋亡也会在病理情况下被诱发。凋亡过程包括Caspase家族蛋白酶水解酶的参与、染色质凝聚、细胞皱缩、DNA降解和片段化、凋亡小体形成等。在这一过程中细胞内容物-般不发生外泄,故不会引起炎症反应。当细胞受到如糖皮质激素、热、辐射、营养缺乏、病毒感染、缺氧和细胞内钙浓度增加等刺激时,细胞内凋亡信号即可被释放。细胞凋亡主要通过线粒体途径或内在途径、死亡受体介导的途径或外在途径、内质网途径以及非caspase依赖性途径被触发。大量研究表明,自噬与凋亡通路之间存在着错综复杂的对话(Cross-talk),两者有共同的刺激因子和调节蛋白。目前认为,凋亡和自噬在介导细胞死亡过程中,存在着如下几种可能的关系:凋亡和自噬协同促进细胞死亡,二者可能同时或先后被活化,协同调控细胞死亡;凋亡和自噬互为拮抗,自噬通过加速受损细胞器或蛋白聚集物的清除,使大分子物质得以循环利用,保护细胞免于凋亡;自噬促进凋亡相关特征的显现,但自噬并不作为诱发细胞死亡的直接原因。众多调控元件参与凋亡和自噬的交互应答机制,包括Beclin1、Bcl-2家族蛋白p53等。在神经根炎发生发展过程中是否存在神经细胞凋亡和自噬尚不清楚。臭氧是一种无色、有刺激性气味的气体,具有不稳定、难以储存、强氧化性、常温常压状态下大约四五十分钟就会转化成氧气等特点。臭氧的使用是一把“双刃剑”,当高浓度或大剂量使用的时候,臭氧对于生物体有着严重的副作用,然而小剂量的较低浓度的臭氧却可以有效的提高血液抗氧化能力。众所周知,医用臭氧具有“杀菌、抗病毒、消炎、镇痛及免疫调节”等多种生物功能,在临床上已经用于腰间盘突出、疼痛、创伤及难治性溃疡、中风和病毒性肝炎等疾病的治疗,而且均有良好的效果。截至目前,关于臭氧疗法的作用机制包括较低浓度的臭氧可以使髓核脱水、缩小,从而一定程度上缓解椎间盘的压迫;医用臭氧可以刺激抗炎因子IL-10和成纤维生长因子-β1(TGF-β1)的释放,可以抑制凋亡蛋白和IL-1β的过度表达,能较好地改善局部氧供,从而减轻炎性反应。但基于自噬和凋亡理论来探讨关于低浓度臭氧治疗神经根炎的内在机制,鲜有研究。鉴于此,本论文拟通过建立大鼠神经根炎模型,观察神经根炎大鼠脊髓组织自噬及凋亡的表达特征,观察低浓度医用臭氧对根神经炎的治疗作用,并且从自噬结合凋亡的角度初步探讨臭氧治疗根神经炎的可能机制。第一部分神经根炎大鼠脊髓组织的自噬和凋亡方法:选取健康清洁级250-300g的Wistar大鼠36只,雌雄不限,随机分为二组,每组18只:模型组(Model group)和假手术组(Shamgroup)。模型组为弗氏佐剂致神经根炎组,将包含50ul完全性弗氏佐剂(complete Freund's adjuvant)CFA的止血氧化纤维素放在L5背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)上,致根性神经炎。假手术组椎板切除后,暴露L4/5右侧椎间孔及L5背根神经节,放置包含50ul生理盐水的止血氧化纤维素。在造模成功后8h、24h、72 h各组分别取3只大鼠,取脊髓,保留L5背根神经节,行电镜观察、免疫荧光双标检测LC3Ⅱ/NeuN表达、免疫组化检测Caspase3表达、RT-PCR法测定组织中Beclinl、LC3B、PDE2A、NF-κBp65mRNA 水平、Western blotting 测定组织中 Beclin1、LC3B、PDE2A、NF-KBp65的蛋白水平,统计分析各组差异的显著性。结果:1.透射电镜观察:通过采用电子显微镜观察胞质中的自噬体来研究神经根炎症大鼠模型中脊髓组织的自噬情况。结果表明,手术造模后,在8 h、1天和3天脊髓组织细胞质中发现一些自噬体,其包含异常结构高电子密度物质(如双膜)和许多细胞器。2.免疫荧光双标检测LC31Ⅱ/NeuN表达:模型组大鼠脊髓组织细胞质出现很多LC3B染色区域。假手术组大鼠脊髓组织细胞质几乎没有LC3B染色区域,假手术组大鼠神经根细胞质NeuN染色区域很少。3.免疫组化检测Caspase3表达:与假手术组相比,模型组大鼠神经根细胞8h、24h、72h时出现较多裂解caspase3阳性染色细胞。4.RT-PCR 法测定组织中 Beclin1、LC3B、PDE2A、NF-KBp65mRNA 水平首先采用标准试剂及方法对定量荧光PCR检测系统进行了校验,结果显示,实验系统与理论值的相关系数达到0.9978,接近1,表明该实验系统可以用来准确地检测基因的mRNA水平。采用该检测系统检测LC3B、Beclin 1、PDE2A、NF-κB p65 mRNA水平,结果显示:与假手术组相比,模型组8h、24h、72 h的Beclin 1、LC3B mRNA水平显著升高。与假手术组相比,模型组72 h的PDE2A和NF-κB mRNA水平明显升高。5.Western blotting 测定组织中 Beclin1、LC3B、PDE2A、NF-κB p65 的表达。与假手术组比,模型组8h、24h、72h的Beclin1、LC3B蛋白水平显著升高。与假手术组比,模型组72 h的PDE2A和NF-κB p65蛋白水平显著升高。结论:本研究成功建立了化学性神经根炎大鼠模型,其脊髓组织中出现自噬特征性结构,自噬生物标志物(LC3B和Beclin1)表达水平升高,凋亡关键指标裂解Caspase 3在脊髓和神经根细胞中的表达升高,凋亡相关指标PDE2A和NF-κB p65的表达水平也升高。因此,化学性神经根炎大鼠脊髓组织及神经细胞出现自噬和凋亡增强现象。第二部分医用臭氧对神经根炎大鼠脊髓组织的自噬和凋亡的影响方法:选取健康清洁级250-300g的Wistar大鼠54只,雌雄不限,随机分为三组,每组18只:A组为模型组(n=18),即弗氏佐剂致神经根炎组(将浸含50ul完全性弗氏佐剂CFA的止血氧化纤维素放在L5背根神经节处)。B组为臭氧治疗组(n=18),建模成功后,硬膜外注入30μg/ml臭氧50μ1。C组为对照组(n=18)。即在L5背根神经节处,放置浸含50ul生理盐水的止血氧化纤维素。建模成功后,模型组和对照组分别给予过滤空气50μl,连续3天。在给药后8h、24h、72 h各组分别取3只大鼠,取脊髓,保留L5背根神经节,行透射电镜观察、免疫荧光双标检测LC3 ⅡI/NeuN表达、免疫组化检测Caspase3 表达、RT-PCR 法测定组织中 Beclinl、LC3B、PDE2A、NF-κB p65 mRNA 表达水平、Western blotting 测定组织中 Beclin1、LC3B、PDE2A、NF-κB p65的蛋白水平。结果:1.透射电镜观察:手术造模后,模型组在8 h、1天和3天脊髓组织中发现一些自噬体,其包含异常结构(如双膜)和许多细胞器。与模型组比较,臭氧治疗组自噬体的数量明显减少。2.免疫荧光双标检测LC3II/NeuN表达:模型组大鼠脊髓组织出现很多LC3B染色区域。与模型组比较,臭氧治疗组LC3B染色区域面积明显降低。而对照组几乎没有LC3B染色区域。同样,模型组大鼠脊髓组织出现很多NeuN染色区域。与模型组比较,臭氧治疗组NeuN染色区域面积降低。对照组NeuN染色区域很少。3.免疫组化检测Caspase3表达:模型组大鼠脊髓组织8h、24h、72h时出现很多裂解caspase3阳性染色细胞。与模型组比较,臭氧治疗组裂解caspase3阳性染色细胞数明显降低,几乎达到对照组大鼠的水平。4.RT-PCR 法测定组织中 Beclin`、LC3B、PDE2A、NF-κB p65mRNA 水平:结果显示:与对照组比,模型组8h、24h、72h的Beclinl和LC3BmRNA水平显著升高。与模型组比,臭氧治疗组8h、24h、72 h的Beclin 1和LC3B mRNA水平均明显降低,然而仍明显比对照组的高。与对照组相比,模型组72 h的PDE2A和NF-κB p65 mRNA水平显著升高。与模型组相比,臭氧治疗组72 h的PDE2A和NF-κB p65 mRNA水平均明显降低,然而仍明显比对照组的高。5.Western blotting 测定组织中 Beclinl、LC3B、PDE2A、NF-κB p65 的表达:Beclin 1蛋白水平:与对照组比,模型组8h、24h、72 h的Beclin 1和LC3B蛋白水平显著升高。与模型组比,臭氧治疗组8h、24h、72h的Beclin1和LC3B蛋白水平均明显降低,然而仍明显比对照组的高。与对照组比,模型组72 h的PDE2A和NF-κB p65蛋白水平显著升高。与模型组比,臭氧治疗组72 h的PDE2A和NF-κB p65蛋白水平均明显降低,然而仍明显比对照组的高。结论:本研究成功建立了化学性神经根炎大鼠模型。治疗浓度3μg/ml的医用臭氧治疗能显著抑制炎症大鼠自噬体的出现及自噬生物标志物(LC3B和Beclin 1)和凋亡关键指标裂解Caspase 3在脊髓组织中的表达。同时,臭氧抑制神经根炎大鼠模型中PDE2A和NF-κB p65的过表达。因此,治疗浓度30μg/ml的臭氧可抑制自噬,减少细胞凋亡,从而用于治疗神经根炎。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R741
【部分图文】：

实验过程,剃毛,模型,组织分离

图１大鼠神经根炎模型造模详细实验过程

质量图,凝胶电泳,质量,沉淀溶解

否则很难溶解。将ＲＮＡ沉淀溶解于适量（２０？５0ｎｌ）的无ＲＮａｓｅ水中。如果ＲＮＡ逡逑沉淀不完全溶解，ＯＤ２６０／ＯＤ２８０小于或等于１．６。其ＲＮＡ溶液可以用于进一步的逡逑实验，或－７（ＴＣ保存。采用凝胶电泳检测提取的ＲＮＡ质量（见

自噬体,电镜观察,胞浆,自噬

１．透射电镜观察逡逑通过采用电子显微镜观察胞质中的自噬体来研宄神经根炎症大鼠模型脊髓逡逑组织细胞的自噬情况。结果表明，手术造模后，８ｈ、２４ｈ、和７２ｈ邋（如图３）的逡逑脊髓组织细胞质中发现一些自噬体，其包含异常结构（如双膜）和许多细胞器。逡逑３１逡逑

【参考文献】