高表达BDNF间充质干细胞源性外泌体对MCAO大鼠脑损伤的保护作用

发布时间：2020-09-09 15:42

　　目的:构建大脑中动脉闭塞(Middle cerebral artery occlusion,MCAO)大鼠模型,模拟人类缺血性脑卒中疾病,观察高表达脑源性神经营养因子(Brain derived neurotrophic factor,BDNF)间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)及其源性外泌体(Exosome,Exo)移植治疗对MCAO大鼠模型的疗效,探讨高表达BDNF-MSCs源性外泌体对MCAO大鼠脑损伤的保护作用及可能机制。方法:选取重量约为250-300g左右的健康雄性成年SD大鼠,用Longe线栓法构造MCAO模型。采用五级四分法,将成功建模的MCAO大鼠随机分组如下(n=8只):模型对照组(MCAO组)、高表达BDNF-MSCs移植组(MCAO+MSCs组)、高表达BDNF-MSCs源性Exo移植组(MCAO+Exo组),另设一组空白对照组(Control组)。于缺血2h再灌注24h后通过尾静脉注射移植行各组移植治疗干预。分别于第1、3、7、14天观察各组神经行为学评分,14天后处死各组大鼠并取标本,通过HE染色脑组织,计算各组脑梗死相对面积,并观察脑组织梗死显微结构,评估神经坏死程度。通过免疫荧光染色统计各组脑组织Ki-67蛋白阳性细胞表达率,观察脑组织脑细胞增殖情况,评估各组脑修复改善水平;Western blot检测BDNF、pTrkB、PI3K和pAkt表达情况。运用Graphpad prism8.0软件分析数据并作图。结果:1、外泌体的鉴定与检测:(1)电镜显示经典外泌体膜状结构及中央低电子密度成分;(2)WB检测外泌体特异性Markers:CD63及TSG101富集性表达;(3)BDNF-Elisa检测:与自然表达BDNF-MSCs组相比,高表达组外泌体内BDNF含量显著升高(P0.01),低表达组外泌体BDNF含量下降(P0.05)。2、大鼠神经行为学功能学评分:(1)第1d,各移植治疗组与MCAO组所得评分相比,无统计学差异(P0.05);(2)与MCAO组相比较,各移植治疗组在第3d、7d、14d的longa评分呈下降趋势(P0.05);(3)高表达BDNF-MSCs移植组与其源性外泌体移植组所得longa评分下降趋势差异无统计学差异(P0.05)。3、治疗后各组大鼠梗死程度:(1)各移植治疗组梗死相对面积较MCAO组均下降(P0.01),且高表达BDNF-MSCs组与其源性外泌体移植组梗死相对面积差异无明显统计学差异(P0.05)。4、脑组织显微镜形态学表现:(1)MCAO组纹状体可见大量紊乱排列的坏死神经细胞、间质水肿、神经元胞浆浓缩深染、细胞核碎裂或溶解或不成形;(2)高表达BDNF-MSCs移植组及其源性外泌体移植组均可见坏死神经元在一定程度上有所减少及间质稀疏水肿的改善,神经元结构较为完整,间质水肿程度较轻。5、免疫荧光染色Ki-67蛋白表达:(1)MCAO组Ki-67蛋白阳性细胞率上升(P0.05),各移植组阳性率较MCAO组呈进一步上升趋势(P0.01),且移植组间阳性率上升程度无明显统计学差异(P0.05)。6、BDNF、pTrkB、PI3K和pAkt蛋白Western blot结果:(1)MCAO组大鼠脑组织内BDNF相对表达水平显著下降(P0.01),各移植治疗组脑组织BDNF表达水平均显著上升(P0.01),且高表达BDNF-MSCs组与其源性外泌体移植组BDNF表达水平上升程度差异无统计学差异(P0.05);(2)MCAO组大鼠脑组织内pTrkB相对表达水平显著下降(P0.01),各移植治疗组脑组织TrkB表达水平均上升(P0.05),且高表达BDNF-MSCs组与其源性外泌体移植组pTrkB表达水平上升程度差异无统计学差异(P0.05);(3)MCAO组大鼠脑组织内PI3K相对表达水平下降(P0.01),各移植治疗组脑组PI3K表达水平均上升(P0.05),且高表达BDNF-MSCs组与其源性外泌体移植组PI3K表达水平上升程度差异无统计学差异(P0.05);(4)MCAO组大鼠脑组织内pAkt相对表达水平显著下降(P0.05),各移植治疗组脑组织pAkt表达水平均上升(P0.05),且高表达BDNF-MSCs组与其源性外泌体移植组pAkt表达水平上升程度差异无统计学差异(P0.05);结论:1、随着MSCs内BDNF表达增加,其分泌的外泌体内含BDNF增加;2、高表达BDNF-MSCs源性外泌体对MCAO大鼠脑损伤具有保护作用,其可能机制是通过PI3K/Akt信号通路的激活发挥脑保护作用。
【学位单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R743.3
【部分图文】：

透射电镜,透射电子显微镜,标尺,图片

3.1 MSCs 源性外泌体鉴定3.1.1 形态学电镜及 Western blot 方法鉴定高表达、自然表达、低表达 BDNF-MSCs 扩培养，待细胞融合度为 60-70%后，换成新鲜的无外泌体血清培养基继续培养 24-48h，细胞融合度达 80-95%时，收集培养基上清液，超速离心过滤，按试剂盒步骤提取外泌体。通过透射电子显微镜可看到数个异质性圆形或类似圆形微小囊泡小体，直径约 30-100nm(图 A)，电镜图片清晰显示外周膜性结构及中央低电子密度成分。分别提取的高表达、自然及低表达 BDNF-MSCs 源性微囊泡，Western blot 定性结果显示所提取微囊泡阳性表达外泌体特异性 Markers:TSG101 及 CD63（图 B）。结合透射电镜的经典外泌体结构以及 Western blot 定性实验结果可鉴定提取物确实为外泌体，而非其他细胞碎片及微小囊泡等结构。

对比图,自然表,对比图,组内

结果如下所示（表 1，图 2，3）：（1）与自然表达 BDN BDNF 含量相比，高表达 BDNF-MSCs 源性外泌体组内1），低表达 BDNF-MSCs 源性外泌体组内含量下降（P＜0表 1 自然表达、高表达及低表达 BDNF-MSCs-Exo 浓度（ X±SN 浓度（pg/ml）BDNF-MSCs源性外泌体组 3 22.47±2.97DNF-MSCs 源性外泌体组 3 46.75±7.95**DNF-MSCs 源性外泌体组 3 12.65±3.91*表达 BDNF-MSCs 源性外泌体组相比，P＜0.05，** P＜0.01。

标准曲线,标准品,标准曲线,圆周运动

图 3 BDNF 标准品 ELISA 标准曲线2 大鼠缺血再灌注模型的成功制备在所需大鼠进行缺血再灌注术后 2h，对术后清醒大鼠进行评估大鼠表现为对侧肢体瘫痪，运动时向一侧偏斜，类似圆周运动。鼠对侧偏瘫侧肢体内收、屈曲时肌张力增高。轻度缺血再灌注表现为完全伸展，前肢较为明显，中度表现为大鼠向一侧行圆周运动，重侧倾倒。模型制备图片如下（图 4、5）：图 4 可见血管的成功结扎插入目标部位，并标记外露线栓尾端。图 5 可见大鼠右侧肢体得偏侧肢体前爪最为明显，并向一侧行圆周运动。

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