帕金森病(Parkinson's disease, PD),是一种常见的中枢神经系统退行性疾病,主要由于环境毒素和(或)遗传因素引起中脑黑质多巴胺(dopamine, DA)能神经元凋亡、坏死,从而出现一系列的静止性震颤、肌强直、运动迟缓和姿势不稳等症状。由于PD病因病机的复杂性,目前尚无理想的治疗方法。西药虽然能控制症状,但长期服用多出现疗效减退或运动障碍加剧等副作用。根据中医对PD病理病机的认识,脑为元神之府,为髓海,在临床上头针治疗PD获得较好的疗效,舞蹈震颤控制区为治疗PD的特效区域。目前已发现脑源性神经营养因子(Brain derived neurotrophic factor, BDNF)对DA能神经元具有较强的保护和促生长作用。故本实验以1-甲基-4-苯基-1,2,4,6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,4,6-tetrahydropyridine, MPTP)诱导PD模型小鼠为研究对象,从BDNF和其酪氨酸激酶受体(Tyrosine receptor kinaseB, TrkB)及其下游信号转导通路探讨针刺舞蹈震颤控制区对PD的治疗作用,揭示针刺治疗PD的可能机制与作用环节,为中医临床针灸治疗PD提供新的思路与实验依据。 本实验分为两部分：(1)通过观察针刺舞蹈震颤控制区对PD小鼠行为学、中脑黑质病理学、DA能神经元丢失的影响,探究其对PD小鼠的治疗作用。(2)运用免疫组化和Western blot方法观察针刺舞蹈震颤控制区对PD小鼠脑内BDNF及其受体TrkB和其下游信号分子的影响,探究针刺治疗PD对DA能神经元保护作用的可能机制及作用环节。 实验选用C57BL/6J小鼠,采用爬杆法进行训练筛选,选取四肢并用且顺利从杆顶爬下的小鼠随机分为5组：正常对照组(简称正常组)、模型对照组(简称模型组)、美多巴治疗组(简称美多巴组)、针刺治疗组(简称针刺组)、针刺结合美多巴治疗组(简称针美组)。正常组不进行任何处理,其余四组采用腹腔注射生理盐水配制的0.2%MPTP溶液,剂量为20mg/(kg·d),连续注射5d,建立PD模型,并进行相应治疗。动物存活期为28d。 主要实验结果如下： 1.针刺舞蹈震颤控制区对PD模型小鼠行为学的影响 腹腔注射MPTP后,小鼠出现不同程度的肢体震颤,竖毛竖尾急性反应。造模5天后小鼠出现体重减轻、毛色暗淡、行动迟缓等表现,爬杆时间延长。对爬杆时间进行评分,与正常组相比,模型组计分比正常组明显减少(P0.05),三个治疗组较模型组均有明显增加(P0.05)。 2.针刺舞蹈震颤控制区对PD模型小鼠黑质病理学的影响 模型组黑质神经元数目与正常组相比有明显减少,并可见细长深染萎缩的神经元,三个治疗组的黑质神经元较模型组增多,残存神经元中形态正常的较多 3.针刺舞蹈震颤控制区对PD模型小鼠DA能神经元的影响 免疫组化结果显示,四个造模组酪氨酸羟化酶(Tyrosine hydroxylase, TH)阳性神经元的数目均较正常组明显减少(P0.05),但针刺组和针美组的数量较模型组和美多巴组增加,其中针美组的数量较美多巴组显著增加(P0.05)。 4.针刺舞蹈震颤控制区对PD模型小鼠脑BDNF的影响 Western blot实验结果显示,模型组脑BDNF的表达比正常组明显降低(P0.05)；而针美组表达比模型组明显增加(P0.05)。 5.针刺舞蹈震颤控制区对PD模型小鼠TrkB的影响 免疫组化结果显示,在黑质致密部：模型组和美多巴组TrkB表达与正常组相比有明显降低(P0.05)；针刺组、针美组表达比模型组明显升高(P0.05)；针刺组表达比美多巴组表达明显升高(P0.05)；针美组表达比针刺组明显降低(P0.05)。 在海马,模型组CA3区TrkB的表达较正常组明显减少(P0.05),针刺组CA1-CA4区比正常组、模型组和美多巴组的表达有明显升高(P0.05)；针美组的CA1和CA2区的表达较模型组明显升高(P0.05)。 6.针刺舞蹈震颤控制区对PD模型小鼠PSD-95的影响 Western blot实验结果显示,模型组、美多巴组和针美组PSD-95表达比正常组明显降低(P0.05),其中美多巴组的表达最低,但针刺组的表达与正常组无明显差别；针刺组及针美组与美多巴组比较,表达量明显上升(P0.05)。 7.针刺舞蹈震颤控制区对PD模型小鼠Akt的影响 免疫组化结果显示,在黑质致密部,针美组Akt与其余各组相比,表达明显升高(P0.05)。其余各组之间无明显差异。 在海马CA1区,模型组、美多巴组和针刺组Akt表达均较正常组有明显下降(P0.05)；针美组在CA1、CA3和CA4区的表达比模型组和美多巴组明显升高(P0.05)；针美组在CA1和CA4的表达比针刺组有明显上升(P0.05)。 结论：(1)采用C57BL/6J小鼠腹腔注射MPTP,从行为学和病理学方面均出现与PD患者发病较相近的变化,表明模型复制成功。脑内BDNF和受体及其突触相关蛋白的减少可能与PD的发病及多巴胺神经元丢失有关。但没有充分证据表明BDNF-TrkB信号转导与磷酯酰基醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)通路有关。(2)单独针刺舞蹈震颤控制区和针刺结合美多巴有一定保护DA神经元的作用,其中针药合用保护效果优于针刺单独使用,而单独应用美多巴无明显的保护作用。(3)单独针刺舞蹈震颤控制区可能通过增加Trk B受体和突触信号整合发挥神经保护作用,但与PI3K/Akt通路关系不大。(4)针刺舞蹈震颤控制区合并美多巴治疗可以在一定程度上通过影响通过调节BDNF-TrkB及PI3K/Akt通路发挥神经保护作用。(5)美多巴单独应用并不能通过TrkB受体和突触信号整合以及PI3K/Akt通路发挥神经保护作用。
【学位单位】：北京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2014
【中图分类】：R742.5
【参考文献】
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2816116
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