铁对MES 23.5多巴胺能细胞Rab家族蛋白的影响及机制

发布时间：2020-09-10 20:34

　　帕金森病(Parkinson's disease,PD)是继阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)后第二大最常见的神经退行性疾病。虽然遗传、环境和老化因素对PD发病均起到一定作用,但确切的发病机制并不清楚。PD最重要的神经病理学特征表现为黑质区残存的多巴胺神经元内出现嗜酸性包涵体,即为路易小体,其主要成分是聚集的α-突触核蛋白。α-突触核蛋白是一种朊病毒样蛋白(Prion-like proteins),通过胞吞和胞吐作用在细胞与细胞间传递,能够被神经元释放,进而被周围的细胞(包括神经元、胶质细胞等)再摄取,从而能够在细胞与细胞之间、相互联系的结构之间进行传递。研究表明,α-突触核蛋白能够通过外泌体(Exosomes)被神经元释放。外泌体是一种30-100nm的膜性囊泡,由细胞内的多泡体(multivesicular bodies,MVBs)和细胞膜融合后释放,进而被周围的细胞再摄取。同时外泌体能够将RNA、DNA、蛋白质等细胞内成分转运至细胞外,作用于邻近或远距离的细胞,从而实现生理及疾病状态下不同细胞间的信息交流,可见于血液、尿液、唾液等生物学样本和体外细胞的培养基中。在外泌体分泌的过程中,Rab蛋白发挥了重要作用。Rab蛋白是一类小分子GTP结合蛋白家族(small GTP-binding proteins),大约由200个氨基酸组成,分子量约21-25kDa。其作为细胞囊泡运输中的分子开关,通过鸟嘌呤核苷酸交换因子(Guanine nucleotide exchange factor,GEF)激活以及与GTP酶活化蛋白(GTP hydrolysis activator protein,GAP)结合失活来调节膜运输中的四个主要步骤:囊泡形成,囊泡转运,囊泡粘附和囊泡膜与靶标的融合。这些不同的步骤通过Rab结合GTP并与上游调控子以及下游效应子相互作用以结合到特定的膜上实现。在人体的所有微量元素中,铁是最丰富的。大脑中的铁浓度随着年龄的增长而增加,在伏隔核,深小脑核,红核,部分海马以及黑质中铁的含量丰富。脑内高铁导致黑质-纹状体系统多巴胺能神经元功能的损伤是神经科学家关注的热点问题,由于铁的细胞毒作用和它能够促进氧自由基产生的能力,使其在PD中的作用不容忽视。目前大量的研究证实,黑质铁聚积参与了PD的发病,在PD病人及动物模型的黑质存在铁选择性的沉积。α-突触核蛋白mRNA5'非翻译区包含铁反应元件(iron responsive element,IRE),其具有铁还原酶活性,且能够调控转铁蛋白介导的铁转运过程,这些证据说明α-突触核蛋白和胞内铁稳态调节的关系密不可分。人类SNCA基因(编码α-突触核蛋白的基因)A53T突变时在铁和多巴胺存在时能够引起α-突触核蛋白聚集。α-突触核蛋白聚合物在储铁过程中发挥重要作用,其过表达导致了神经元铁聚集和铁再分配。然而,细胞内高铁对外泌体介导的α-突触核蛋白释放的影响尚不清楚。本研究在MES 23.5多巴胺能细胞系中,通过免疫印迹、铁试剂盒等方法探讨细胞内高铁状态下是否影响外泌体α-突触核蛋白的释放及铁含量的影响,同时探讨与外泌体分泌相关的Rab蛋白的变化。研究结果如下:1.100μmol/L和1 mmol/L枸橼酸铁铵(ferric ammonium citrate,FAC)处理MES 23.5细胞4 h、12 h、24 h、48 h后,100μmol/L组在4 h和12 h时,Rab35蛋白表达升高54.99%和1.07倍,与对照组相比,差别有统计学意义(P0.01);1 mmol/L FAC处理组与对照组相比,Rab35蛋白表达分别升高80.12%和79.45%,差别有统计学意义(P0.05,P0.001)。100μmol/L和1 mmol/L FAC处理MES23.5细胞24h和48h后,Rab35蛋白表达均回到基础水平。Rab5、Rab7、Rab11、Rab27a在各个时间点没有明显的变化。2.0.5 mmol/L抗氧化剂N-乙酰基-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)与100μmol/L FAC共孵育MES 23.5细胞4 h和12 h后,结果显示单独NAC处理组Rab35的表达即明显上调,与对照组相比,4 h上调1.24倍,12 h上调1.37倍,差别有统计学意义(P0.001);FAC单独处理4 h组、NAC与FAC共同处理4 h组与对照组相比,分别高出89.21%、1倍,共同处理组与FAC单独处理组相比没有差别。FAC单独处理12 h组、NAC与FAC共同处理12 h组与对照组相比,分别高出1.41倍、1.17倍,差别均有统计学意义(P0.001)。共同处理组与FAC单独处理组相比没有差别。结果提示,抗氧化剂NAC无法阻断高铁诱导的Rab35蛋白水平上调。3.铁死亡抑制剂Liproxstatin-1单独处理12 h后,Rab35的表达没有变化。用10μmol/L Liproxstatin-1预处理30 min后,与100μmol/L FAC共处理MES 23.5细胞12 h,与对照组相比,FAC单独处理组Rab35表达上调22.10%,FAC与Liproxstatin-1共同处理组表达上调22.73%,差别均有统计学意义(P0.01),FAC与Liproxstatin-1共同处理组与FAC单独处理组相比没有差别。铁死亡抑制剂Ferrostatin-1单独处理12h后,Rab35表达上调36.15%,差别有统计学意义(P0.01)。用10μmol/L Ferrostatin-1预处理30 min后,与100μmol/L FAC共处理MES 23.5细胞12 h,Rab35的表达没有明显的变化。结果提示,铁死亡抑制剂Liproxstatin-1无法阻断高铁诱导的Rab35蛋白水平上调,铁死亡抑制剂Ferrostatin-1可能阻断高铁诱导的Rab35蛋白水平上调。4.应用超速离心法提取外泌体,免疫印迹方法检测到Alix的表达,提示外泌体提取成功。100μmol/L FAC处理MES 23.5细胞24 h和48 h后,MES 23.5细胞外泌体中铁含量明显增加,与对照组相比,分别高出96.01%、2.21倍,差别有统计学意义(P0.01,P0.001);处理48 h组与24 h组相比,高出69.20%,差别有统计学意义(P0.01)。以上结果提示,细胞内高铁促进MES 23.5细胞外泌体中铁含量增加。5.携带α-突触核蛋白的过表达载体转染MES 23.5细胞24 h后,细胞内、上清、外泌体中α-突触核蛋白表达明显增加。在α-突触核蛋白过表达的细胞中,100μmol/L FAC处理MES 23.5细胞24 h后α-突触核蛋白上调67.47%(P0.01),与未处理组相比,差别有统计学意义。6.在α-突触核蛋白过表达的MES 23.5细胞中,Rab35表达没有变化,提示α-突触核蛋白本身不影响Rab35表达。100μmol/L FAC处理24h后,Rab35没有明显的变化,与前述未高表达α-突触核蛋白的细胞中FAC处理24h后Rab35蛋白表达回到基础水平的结果一致。以上结果表明,铁能够诱导MES 23.5细胞Rab35蛋白表达的上调,抗氧化剂NAC和铁死亡抑制剂Liproxstatin-1不能阻断铁诱导的Rab35蛋白表达上调,而铁死亡抑制剂Ferrostatin-1可能阻断高铁诱导的Rab35蛋白水平上调。提示氧化应激可能不参与这一过程,铁死亡可能参与这一过程。铁能够促进MES 23.5细胞中α-突触核蛋白表达上调,外泌体中铁含量的增加。α-突触核蛋白本身对Rab35的表达没有影响。本实验在MES 23.5细胞中探讨了铁对MES 23.5细胞外泌体α-突触核蛋白释放的影响及机制,为进一步阐明PD发病过程中铁代谢异常与α-突触核蛋白相互作用的机制提供了新的实验依据。
【学位单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R742.5

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