经血源性子宫内膜干细胞对实验性自身免疫性脑脊髓炎的治疗效果及作用机制研究

发布时间：2020-09-11 14:08

　　背景多发性硬化症(Multiple Sclerosis,MS)是一种中枢神经系统自体免疫性疾病,即机体自身的免疫系统对环绕在神经轴突上的髓鞘发动进攻,导致髓鞘脱落并形成病灶。实验性自身免疫性脑脊髓炎(Experimental Autoimmune Encephalomyelitis,EAE)的病理特征与MS非常相似,因此成为研究和治疗MS的重要动物模型。经血源性子宫内膜干细胞(Menstrual blood-derived mesenchymal stem cells,MenSC)由于其获取的无侵略性、短周期和可重复性,其优势对比其他来源的间充质干细胞,如骨髓、脐带、脂肪、胎盘和胚胎干细胞等更为明显,且未检索到利用MenSC来治疗EAE的文献报道。另一方面,虽然有一些用其他类型干细胞治疗EAE的文献报道,但其作用机制仍不十分清楚,因此本课题旨在探究MenSC对EAE的治疗效果及可能的分子及细胞机制。目的1.建立MenSC的分离培养体系。2.建立小鼠EAE模型。3.探究MenSC移植治疗小鼠EAE的效果。4.探究MenSC治疗小鼠EAE的作用机制。方法1.从新鲜的经血样本中提取、培养和鉴定间充质干细胞,为后续实验提供高质量和足够数量的经血源性子宫内膜干细胞。2.构建小鼠EAE模型,通过皮下注射含MOG_(35-55)和有热灭活的结核分枝杆菌的完全弗氏佐剂(CFA)的乳化液,并于当天和第二天分别尾静脉注射相同剂量的百日咳毒素(PTX)来构建小鼠EAE模型。3.细胞移植采用尾静脉注射和腹腔注射;动物解剖,从脾脏、淋巴结等各个器官中提取免疫细胞,进行细胞表面和胞内染色,用流式细胞术对其进行分类和鉴定。结果1.用本实验建立的培养体系,从经血样本中成功提取出间充质干细胞,经流式细胞术鉴定后表明其符合国际间充质干细胞的认证标准。2.分别在EAE诱导前一天(day-1)、第6天(day6)、第10天(day10)和第19天(day19)注射同等剂量(1×10~6个/只)的MenSC,结果表明:在day-1、day6和day10这三个时间点注射干细胞均能不用程度地抑制EAE疾病的进展,day6尤为明显,但在day19注射干细胞并不能改善EAE的临床评分。3.尾静脉注射和腹腔注射同等剂量的MenSC,从EAE临床评分结果来看,两种注射方式均能显著改善EAE的临床症状,但相比腹腔注射,尾静脉注射的抑制效果更好。4.对比未注射MenSC的EAE小鼠,经MenSC治疗过的小鼠,其外周免疫器官和中枢神经系统(CNS)中的CD4~+T细胞、Th1和Th17细胞所占比例明显降低,且外周神经系统中的MOG特异性T细胞Th1和Th17的比例也明显降低。结论1.对小鼠EAE模型进行细胞移植治疗时,细胞移植时间点的选择对EAE的临床评分有直接的影响,day-1、day6和day10注射MenSC均能改善EAE的临床症状,且day6注射的治疗效果最好,但在day19注射MenSC不能降低EAE的临床评分。2.MenSC进入EAE小鼠体内可能是通过抑制外周免疫器官和CNS中CD4~+T细胞、MOG特异性T细胞、Th1和Th17细胞来发挥作用的。
【学位单位】：新乡医学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R742.9
【部分图文】：

流式细胞术,细胞表面,流式,鉴定图

19图 2 MenSC 的流式鉴定图注：将收获的 P3 的 MenSC 进行细胞表面染色，运用流式细胞术检测到其表面应该表达和不应该表达的标记物。Fig. 2 Identify of MenSC by Flow cytometryNote: MenSC were stained from passage 3 to test the markers should or should’t be express by flowcytometry.

染色效果,流式,图注,小鼠

图 8 对 EAE 小鼠脾脏中 CD4+T 细胞的持续追踪注：A：流式染色效果。B：通过流式细胞术统计不同时间点 CD4+T 细胞的占比情况。Fig. 8 Tracing of CD4+T cells in spleen of EAE miceote: A: Showed the quality of the staining after testing the single cells from spleen of EAE mice.tatistics of CD4+T cells in spleen on different time points by flow cytometry..2.2 CD4+T 细胞在中枢神经中的百分比与小鼠疾病的相关性为了探究 EAE 小鼠中枢神经系统中的 CD4+T 细胞的浸润情况，以 na ve 小鼠照，在 day19 取 EAE 小鼠的脊髓和脑，在提取到 EAE 小鼠脑和脊髓的单个核细，计数定容到 8×106个/mL，后取 500μL 与 500μL 的 MOG 刺激液混合后，于恒养箱中（37℃，5%CO2）刺激 6 个小时后，收获细胞，染色后，通过流式细胞术其中枢神经系统中 CD4+T 细胞的浸润情况，结果显示，对比 na ve 小鼠，EAE 中枢神经系统中 CD4+T 细胞的占比大大增加，这说明 EAE 小鼠之所以发病的原一与大量的 CD4+T 细胞在中枢神经系统中的浸润有关。

对比检测,中枢神经系统,小鼠,情况

图 9 在 EAE 诱导后第 19 天，对比检测 EAE 和健康小鼠中枢神经系统中 CD4+T 细胞的浸润情况图注：A：流式染色效果。B：健康小鼠和 EAE 小鼠中枢神经系统中 CD4+T 细胞的占比差异。Fig. 9 Infiltration of CD4+T cells in CNS of EAE and na ve mice on day19Note: A: Showed that the quality of the staining after testing the single cells from brain and spinal cordof EAE mice. B: Difference of CD4+T cells in CNS of EAE and na ve mice by flow cytometry.2.2.3 MenSC 对外周免疫器官和中枢神经系统中的 CD4+T 细胞的抑制作用被诱导后的小鼠在 day6 时，以尾静脉的方式给小鼠注射 106个 MenSC，在 day15时，取小鼠脾脏，引流淋巴结，脑和脊髓中的单个核细胞，计数定容到 8×106个/mL，后取 500μL 与 500μL 的 MOG 刺激液混合后，于恒温培养箱中（37℃，5% CO2）刺激 6 个小时后，收获细胞，染色经流式检测后，实验数据表明，经过 MenSC 治疗过的小鼠，无论是在脾脏、引流淋巴结还是脑和脊髓中，CD4+T 细胞的数量均比未处理组低，且在脾脏中 CD4+T 细胞的减少尤为显著。

【参考文献】