目的：探讨血管活性肠肽(vocative intestinal peptide,VIP)对实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental allergic encephalomyelitis,EAE)大鼠的防治作用及其免疫学机制,为VIP治疗多发性硬化(multiple sclerosis,MS)寻找理论依据。方法：通过随机双盲法,将60只雌性Wistar大鼠(200g-250g/只)分成4组,每组各15只：正常对照组、EAE对照组、VIP低剂量防治组和VIP高剂量防治组。将粗制髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein,MBP)+完全福氏佐剂complete freud's adjuvant,CFA)注入EAE对照组及VIP低、高剂量防治组大鼠双侧后肢足掌皮下(0.2ml/100g)进行主动免疫,正常对照组给予等量生理盐水+CFA,免疫后0小时及48小时分别给各组大鼠腹腔注射百日咳素(pertussis toxin,PTX)(0.2ml/只)建立EAE模型。自造模当日起,VIP低、高剂量防治组每隔一日分别腹腔注射VIP 4nmol/kg (0.2ml)、16nmol/kg (0.8ml),正常对照组及EAE对照组每隔一日腹腔注射0.8ml生理盐水,连续10天。将连续3天症状评分无加重、四肢瘫痪或死亡作为各组大鼠发病高峰期,在发病高峰期处死大鼠,未发病大鼠观察8周后处死。保留大鼠下腔静脉血、脑脊髓组织及脾脏。1.记录发病大鼠潜伏期、进展期和高峰期神经功能障碍评分变化。2.观察各组发病大鼠脑脊髓组织基本病理改变。3.通过免疫组织化学法,采用抗胶质纤维酸性蛋白抗体(GFAP)检测各组大鼠脑组织内的星型胶质细胞活化情况；用髓鞘碱性蛋白(MBP)抗体染色标记各组大鼠脑白质内的髓鞘,观察其脱失情况。4.流式细胞仪检测各组大鼠脾脏中CD4+CD25+Treg/CD4+T细胞比例变化。5.放射免疫法检测各组大鼠脑组织匀浆中IL-17A、TGF-β1因子含量变化。6.酶联免疫吸附法(ELISA法)检测血清中IFN-γ、IL-4因子含量变化。7.将EAE对照组及VIP各剂量防治组指标进行相关性分析。结果： (1)大鼠发病情况：正常对照组大鼠未发病,EAE对照组及VIP各剂量防治组大鼠均出现不同程度的临床症状。发病大鼠先后表现为食量下降、精神萎靡、后肢无力、尾部拖地,在免疫后第14-17天症状最为典型：大鼠出现双侧后肢无力拖地、行走画圈、爬行困难、自伤后肢、精神极度衰弱、抽搐、甚至死亡。①潜伏期：与EAE对照组比较,VIP各剂量防治组大鼠发病潜伏期均延长,差异有统计学意义(P0.01),VIP高剂量防治组潜伏期较VIP低剂量防治组延长(P0.01)；②进展期：与EAE对照组比较,VIP各剂量防治组进展期均缩短(P0.05、P0.01)；VIP高剂量防治组进展期较VIP低剂量防治组明显缩短(P0.05)；③高峰期神经功能障碍评分：与EAE对照组相比,VIP低剂量防治组神经功能障碍评分降低,但差异不具有统计学意义(P0.05),VIP高剂量防治组神经功能障碍评分较EAE对照组及VIP低剂量防治组均明显降低(P0.01)。(2)脑脊髓组织病理改变：正常对照组大鼠脑脊髓未见炎细胞浸润；与EAE对照组比较,VIP各剂量防治组炎细胞浸润评分均显著(P0.01)；与VIP低剂量防治组比较,VIP高剂量防治组炎细胞浸润评分明显降低(P0.01)。 (3)脑组织免疫组化结果①星型胶质细胞活化情况：正常对照组脑组织中未见GFAP阳性细胞；EAE对照组大鼠脑组织侧脑室旁可见活化的星形胶质细胞呈弥漫性分布；VIP各剂量防治组中GFAP阳性细胞数有所减少,以血管周围反应明显。与EAE对照组比较,VIP各剂量防治组脑组织侧脑室旁GFAP阳性细胞的平均光密度值(IOD)明显减小(P0.01、P0.05)；与VIP低剂量防治组比较,VIP高剂量防治组GFAP阳性细胞的平均光密度值(IOD)明显减小(P0.01)；②髓鞘脱失变化：正常对照组髓鞘保持完整；在EAE对照组、VIP各剂量防治组脑组织侧脑室旁出现了不同程度脱髓鞘脱失。与EAE对照组比较,VIP各剂量防治组脑组织侧脑室旁MBP染色阳性表达的平均光密度值(IOD)明显增加(P0.01、P0.05)；与VIP低剂量防治组比较,VIP高剂量防治组脑组织侧脑室旁MBP阳性表达的平均光密度值(IOD)明显增加(P0.01)。(4)脾组织CD4+CD25+Treg/CD4+T细胞比例变化：与正常对照组比较,EAE对照组脾组织中CD4+CD25+Treg/CD4+T细胞比例明显降低(P0.01)；与EAE对照组比较,VIP各剂量防治组大鼠脾组织中CD4+CD25+Treg/CD4+T细胞比例明显升高(P0.01、P0.05)；与VIP低剂量防治组比较,VIP高剂量防治组大鼠脾组织CD4+CD25+Treg/ CD4+T细胞比例显著上升(P0.01)。 (5)脑组织匀浆中IL-17A、TGF-β1含量变化：与正常对照组比较,EAE对照组、VIP各剂量防治组大鼠脑组织匀浆IL-17A水平明显升高(P均0.01)；与EAE对照组比较,VIP各剂量防治组大鼠脑组织匀浆中IL-17A水平均显著降低(P0.01)；与VIP低剂量防治组比较,VIP高剂量防治组脑组织匀浆中的IL-17A水平明显降低(P0.01)。与正常对照组相比,EAE对照组、VIP各剂量防治组大鼠脑组织匀浆TGF-β1水平明显降低(P0.01、P0.05),与EAE对照组相比,VIP各剂量防治组大鼠脑组织匀浆TGF-α1水平均显著升高(P0.01)；与VIP低剂量防治组比较,VIP高剂量防治组大鼠脑组织匀浆中TGF-α1水平明显上升(P0.01)；(6)血清中IFN-γ、IL-4含量变化：与正常对照组比较,EAE对照组、VIP各剂量防治组大鼠血清中IFN-γ含量明显升高(P0.01、P0.05)；与EAE对照组比较,VIP各剂量防治组血清中IFN-γ含量显著降低(P0.01、P0.05);与VIP低剂量防治组比较,VIP高剂量防治组血清中IFN-y含量明显降低(P0.05)。与正常对照组比较,EAE对照组、VIP各剂量防治组大鼠血清中IL-4水平均明显降低(P0.01)；与EAE对照组比较,VIP各剂量防治组血清中IL-4水平均显著提高(P0.01)；与VIP低剂量防治组比较,VIP高剂量防治组血清中IL-4水平明显提高(P0.01)。(7)相关性分析：①EAE对照组、VIP各剂量防治组大鼠发病高峰期神经功能障碍评分与脑组织匀浆中IL-17A含量及血清IFN-y水平均呈正相关(P0.01),与脾组织电CD4+CD25+Treg/CD4+T细胞比例、脑组织匀浆中TGF-β1含量及血清中IL-4水平均呈负相关(P0.01)。②EAE对照组、VIP各剂量防治组大鼠发病高峰期炎性细胞浸润程度评分与脑组织匀浆中IL-17A含量及血清IFN-γ水平呈正相关(P0.01),与脾组织CD4+CD25+Treg/CD4+T细胞比例、脑组织匀浆中TGF-β1含量及血清中IL-4水平呈负相关(P0.01)。③EAE对照组、VIP各剂量防治组大鼠高峰期脑组织GFAP阳性细胞的平均光密度值(IOD)与脑组织匀浆中IL-17A含量及血清IFN-γ水平呈正相关(P0.01),与脾组织CD4+CD25+Treg/CD4+T细胞比例、脑组织匀浆中TGF-β1含量及血清中IL-4水平呈明显负相关(P0.01)。④EAE对照组、VIP各剂量防治组大鼠发病高峰期脑组织MBP阳性表达的平均光密度值(IOD)与脑组织匀浆中IL-17A含量及血清IFN-y水平与呈明显负相关(P均0.01),与脾组织CD4+CD25+Treg/CD4+T细胞比例、脑组织匀浆中TGF-β1含量及血清中IL-4水平呈正相关(P0.01)。结论：1.EAE大鼠存在Th1/Th2细胞因子、Th17/CD4+CD25+Treg细胞因子比例失衡。发病高峰期体内Th1型细胞因子IFN-γ及Th17型细胞因子IL-17升高,Th2型细胞因子IL-4及Treg细胞因子TGF-β1降低,免疫格局向Thl型偏移,同时破坏了CD4+CD25+Treg细胞介导的外周及中枢免疫耐受,该免疫平衡的破坏影响着EAE大鼠发病的潜伏期、进展期和高峰期神经功能障碍评分。2.VIP通过延长EAE大鼠发病潜伏期、缩短进展期、降低神经功能障碍评分等缓解EAE的临床症状,同时通过减轻脑脊髓组织炎细胞浸润、抑制星型胶质细胞活化及髓鞘脱可失改善EAE的病理损害,从而对发挥EAE发病的防治作用。3.VIP通过激活Th2细胞、上调CD4+CD25+Treg细胞数量及分泌功能,抑制Thl细胞、Th17细胞活性,保持Thl/Th2细胞,Th17/CD4+CD25+Treg细胞平衡,促进抑炎因子IL-4、TGF-β1产生,抑制致炎因子IFN-γ、IL-17生成,维持中枢及外周免疫耐受,减轻临床表现及病理改变,对EAE大鼠发挥保护作用。
【学位单位】：四川医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2015
【中图分类】：R744.51
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本文编号：
2816844
