MuSK阳性重症肌无力的血清学诊断和动物模型的构建

发布时间：2020-09-11 18:18

　　 背景:重症肌无力(myasthenia gravis,MG)是一种自身免疫疾病,研究表明,其发生机制主要是机体产生针对神经肌肉接头(neuromuscular junctions,NMJs)相关蛋白的自身抗体。自身抗体针对的蛋白主要包括抗乙酰胆碱受体(acetylcholine receptor,AChR)、肌肉特异性激酶(muscle-specific kinase,MuSK)、脂蛋白相关蛋白4(lipoprotein receptor-related protein 4,Lrp4)以及集聚蛋白(agrin)等。其中抗AChR型重症肌无力患者最为常见,约占总患者的80%,其次是抗MuSK型MG(MuSK-MG)。MuSK-MG发病机制主要是由于自身抗体与肌细胞上MuSK结合并阻碍其信号传递功能,抑制AChR聚集,导致神经肌肉接头终板电位减弱。目前临床上的对症治疗对大多数抗AChR型重症肌无力患者有较好的疗效,但对MuSK-MG患者疗效甚微。因此MuSK-MG也被称为难治性重症肌无力,成为临床上治疗的难题。腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV),作为目前广泛利用的基因治疗工具,能安全有效地运用于动物体。我们在本课题中检验了MuSK-MG患者血清中自身抗体的主要结合位点,并探索利用重组AAV在实验性MuSK自身免疫性重症肌无力(experimental autoimmune myasthenia gravis,EAMG)小鼠模型中进行抗原特异性治疗的可行性。目的:鉴定MuSK-MG患者抗体主要结合位点,构建MuSK-EAMG小鼠模型,探索利用重组AAV进行干预治疗的可行性。方法:构建MuSK胞外段重组载体并体外表达纯化MuSK胞外段蛋白,利用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测自身抗体的主要结合位点,免疫小鼠构建MuSK-EAMG模型,并检验小鼠抗MuSK抗体滴度和行为学表现,运用重组AAV探索对MuSK-EAMG的治疗可行性。结果:(1)表达并纯化MuSK胞外段蛋白;(2)利用ELISA技术,在85例MG患者中,鉴定出22例抗MuSK抗体阳性,并发现这些患者中的自身抗体主要针对MuSK胞外段的Ig1结构域;(3)使用纯化的MuSK胞外段蛋白免疫小鼠,获得MuSK-EAMG小鼠模型;(4)rAAV9型病毒可以高效感染小鼠骨骼肌。结论:我们鉴定发现约26%的MG患者血清中带有抗MuSK抗体,抗体的主要结合位点为MuSK蛋白的Ig 1结构域;利用AAV过表达Ig 1结构域或对应的多肽片段,可能特异性阻断自身抗体与内源蛋白的结合,从而对MuSK-MG进行抗原特异性的治疗。
【学位单位】：华中科技大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R746.1
【部分图文】：

介导神经肌肉接头形成发育的分子机制

4 实验结果4.1 构建 MuSK 胞外段真核表达载体为了检测重症肌无力患者体内是否有抗 MuSK 抗体，需要利用 M白检测患者血清抗体与之结合的能力，因此我们构建了 MuSK-ecto 体。主要目的有二：其一，利用 MuSK-ecto 蛋白检测 MG 患者中 M概率，从而研究 MuSK-MG 抗体致病机制；其二，利用 MuSK-ecto鼠构建 MuSK-EAMG 模型。MuSK-ecto 真核表达载体的构建过程如图 2。我们设计 SD 大鼠cDNA 上下游引物序列（具体操作见实验方法），用分子克隆技术得到的 PCR 扩 增 产 物 （ 图 2B ） 。 再 将 目 的 片 段 连 接 到真 核pcDNA3.1-myc/HisA 中(图 2A)。构建得到的重组质粒转染 HEK293表达得到 MuSK-ecto 蛋白（2D）。A

图 3：正常对照和重症肌无力患者血清抗 MuSK 抗体检测（A）正常对照和 85 位重症肌无力患者血清抗 MuSK 抗体 ELISA 检测结果；（B）M阴性和 MuSK 阳性 MG 患者 ELISA 检测结果。所检测的重症肌无力患者中有 22 例表MuSK 阳性。4.2.1 MuSK 胞外段各结构域的表达研究表明 MuSK-MG 患者体内的自身抗体主要与神经肌肉接头突触后MuSK 的胞外段结合[28]。MuSK 蛋白为单次跨膜蛋白，具有胞外段和胞内段中胞内段具有酪氨酸激酶活性，负责激活下游信号传导。而胞外段是 MuSKLrp4 蛋白的主要结合位点，是接受 agrin-Lrp4 信号传递的主要区域。根据蛋一级结构，MuSK 胞外段可分为 4 个结构域（图 4A），包括 3 个类似免疫白的结构域（简称为 Ig1、Ig2、Ig3），以及一个半胱氨酸富集区（cystine richdomCRD 或 Frizzled 结构域，FZ）[29]。

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