microRNA-148a-3p通过靶向调控ST18促进神经胶质瘤细胞的迁移和侵袭

发布时间：2020-09-12 14:30

　　 目的:现如今,神经胶质瘤是中枢神经系统疾病中较为普遍的原发性颅脑恶性肿瘤。该疾病具有发病率高、致死率高、预后差等疾病特点,目前国内外临床治疗神经胶质瘤所采用的治疗方案基本以手术治疗为主并辅助放化疗的综合治疗方案。尽管患者接受目前临床治疗方案,但神经胶质瘤术后生存率及复发率仍处于一个不容乐观的局面。本课题以小分子RNA(microRNA,miRNA)miR-148a为研究对象,在脑胶质瘤细胞系中筛选潜在靶基因肿瘤抑制子18(Suppression of Tumorigenicity 18 ST18),并对所筛选靶基因进行验证,同时研究其在miR-148a调控下,对多形性神经胶质母细胞瘤(Glioblastomamultiforme,GBM)生物学功能的影响。为将来临床靶向治疗GBM提供新的方向和思路奠定理论基础。方法:1.利用生物信息学数据库(TargetScan、miRanda、miRBase)筛选miR-148a-3p的潜在靶基因:使用目前生物信息学研究中常用的靶基因预测数据库包括,从其中查找出miR-148a潜在靶基因,利用文献阅读排除目前生物信息学在GBM领域研究的miR-148a的靶基因,选择可能性较大的靶基因ST18作为本课题研究的靶基因。2.运用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western Blotting手段检测ST18基因在各GBM细胞系中的表达程度:通过qRT-PCR及Western Blotting手段测定ST18基因在永生化神经胶质细胞(HA1800)和脑胶质瘤细胞系(U87、U251)中的mRNA和蛋白表达水平;并检测ST18基因在miR-148a不同表达条件下(过表达或抑制表达)的脑胶质瘤细胞系中的mRNA和蛋白表达水平。3.利用荧光素酶报告基因实验检测miR-148a与ST18基因的靶向关系:在HEK-293T细胞中,利用荧光素酶报告基因实验验证miR-148a-3p与ST18靶基因的靶向关系。4.利用Transwell迁移和侵袭实验以及划痕实验来检测miR-148a-3p调控ST18基因对神经胶质瘤细胞迁移和侵袭的生物学功能影响:在神经胶质细胞瘤细胞U87和U251细胞系中,利用划痕实验和Transwell迁移实验检测miR-148a-3p调控ST18基因对神经胶质瘤细胞迁移能力的影响;利用Transwell侵袭实验检测miR-148a-3p调控ST18基因对神经胶质瘤细胞侵袭能力的影响。结果:1.成功筛选出研究靶基因,ST18为miR-148a-3p的潜在靶基因之一:各生物信息学数据库数据显示,ST18是miR-148a-3p的下游靶向调控靶基因。2.ST18基因在脑胶质瘤细胞中呈现低表达:qRT-PCR结果显示,在脑胶质瘤细胞系(U87、U251、T98G)中ST18基因的mRNA表达水平较永生化胶质细胞(HA1800)明显降低。3.miR-148a-3p靶向调控ST18基因:过表达或抑制miR-148a-3p表达后,利用qRT-PCR和Western blotting分别检测脑胶质瘤细胞系(U87、U251)中ST18基因的mRNA和蛋白表达情况发现,在过表达miR-148a-3p的脑胶质瘤细胞中,ST18基因的mRNA和蛋白表达水平较对照组明显降低;抑制miR-148a-3p表达时,各胶质瘤细胞系中ST18基因的mRNA和蛋白表达水平较对照组明显增高。此外,在转染报告基因质粒的HEK-293T细胞中,荧光强度检测结果显示:ST18-WT+miR-148a实验组与ST18-WT+miR-148a-NC对照组相比较,ST18-WT+miR-148a实验组组荧光强度明显下降,且具有统计学差异(P0.05)。表明,在脑经胶质瘤细胞中miR-148a-3p直接作用于ST18。4.miR-148a-3p通过调控ST18进一步增强神经胶质细胞瘤的迁移能力:在脑胶质瘤细胞U87和U251中,将ST18基因过表达后进行划痕实验,发现ST18基因过表达后能显著降低脑胶质瘤的迁移能力;另一方面,通过Transwell验证细胞的迁移能力时我们观察到,ST18过表达能够降低神经胶质瘤细胞迁移能力;且过表达ST18基因同时过表达miR-148a-3p能够显著恢复神经胶质瘤细胞的迁移能力。表明,miR-148a-3p能够通过靶向调控ST18基因促进神经胶质瘤细胞迁移。5.miR-148a-3p靶向调控ST18基因促进神经胶质细胞瘤细胞侵袭能力:在神经胶质瘤细胞U87和U251中,利用Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力,结果显示,ST18过表达能够降低脑胶质瘤细胞侵袭能力;且过表达ST18基因同时过表达miR-148a-3p能够显著恢复神经胶质瘤细胞的侵袭能力。表明,miR-148a-3p能够通过靶向调控ST18基因促进神经脑瘤细胞侵袭能力。结论:1.ST18是miR-148a-3p的靶基因之一。2.miR-148a-3p靶向调控ST18基因促进神经胶质瘤细胞的迁移与侵袭。
【学位单位】：湖南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R739.41

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本文编号：2817750