五味子醇甲抑制神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞增殖及迁移机制的研究

发布时间：2020-09-17 19:23

　　背景神经母细胞瘤(Neuroblastoma,NB)属于神经内分泌肿瘤,可起源于交感神经系统的任意神经脊部位,其最常见的原发部位是交感神经链和肾上腺髓质,但也可发生于颈部、胸部、腹部以及盆腔的神经组织等部位。将近一半的NB发生于2岁以内的婴幼儿,少数患者可转化成良性肿瘤甚至自然消退,但大部分治疗仍存在较大难度,且预后不良。目前NB的治疗方式仍以手术、化疗和放疗为主,但由于放疗、化疗等治疗手段会对人体产生严重的毒副作用,因此迫切需要寻找新的安全有效的药物。研究报道五味子具有重要的抗癌功能,五味子醇甲作为五味子木脂素的主要成分,其抗癌效果也被多次报道,但具体机制尚不明确。由于五味子醇甲属于小分子脂溶性物质,可能会通过血脑屏障,因而该药可为神经疾病的治疗提供支持。本次实验首次选用五味子醇甲处理神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞,探索该药是否能够抑制SH-SY5Y细胞的增殖和迁移,并探讨其可能的机制,所得结果可能为NB的临床治疗提供新的研究靶点。目的通过探索五味子醇甲抑制神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞增殖及迁移的可能机制,为用五味子醇甲作为临床药物治疗NB提供新的理论支持。方法1.神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞中分别加入不同浓度的五味子醇甲,经不同时间处理后用MTT检测细胞活性,确定五味子醇甲适宜作用时间和浓度。2.SH-SY5Y细胞加入不同浓度的五味子醇甲处理后通过DAPI染色和流式技术检测细胞是否发生凋亡。根据实验结果,选用qRT-RCR和Western Blot实验检测Bcl-2、Bcl-xl、Bax和p-AMPK等基因mRNA和蛋白的表达水平。3.SH-SY5Y细胞加入不同浓度的五味子醇甲处理后通过流式细胞仪进行活细胞周期检测。并根据实验现象,通过qRT-RCR和Western Blot实验检测cyclinD1、CDK4和P21等基因mRNA和蛋白的表达水平。4.SH-SY5Y细胞加入不同浓度的五味子醇甲处理后通过划痕实验检测细胞迁移程度;并将相同浓度的五味子醇甲加至200个/mL浓度的细胞中,连续培养多天后观察细胞集落克隆结果。根据此实验现象,分别用qRT-RCR和Western Blot实验检测MMP9、HIF-1α和VEGF等基因的mRNA和蛋白的表达水平。结果1.SH-SY5Y细胞经不同浓度的五味子醇甲分别处理,经不同时间处理后,MTT结果显示:与空白对照组相比,五味子醇甲处理组细胞随着药物浓度增加和处理时间的延长,增殖抑制率明显增加,与药物作用时间和剂量成正相关。2.DAPI染色和流式凋亡检测结果显示与对照组相比,五味子醇甲处理组细胞凋亡数目增多,且核凋亡现象明显。qRT-RCR结果显示:与对照组相比Bcl-2和Bcl-xl的mRNA表达水平呈下降趋势;Western Blot结果显示Bcl-2的蛋白表达水平降低,而Bax和p-AMPK的蛋白表达水平增加。3.流式技术检测各处理组细胞周期分布情况,结果显示:与对照组相比,随药物浓度增加,G2/M期细胞比例增加,G1期比例减少,即发生了G2/M期周期阻滞。qRT-RCR和Western Blot结果显示:与对照组相比cyclinD1、CDK4的mRNA和蛋白表达水平均降低,与五味子醇甲剂量呈负相关,但P21的蛋白表达水平升高,与药物剂量呈正相关。4.划痕实验结果显示:与对照组相比,五味子醇甲处理组细胞迁移能力明显减弱;集落克隆实验结果显示:药物处理组细胞克隆数目及大小与对照组相比明显减少,与药物浓度呈负相关。qRT-RCR和Western Blot结果显示:MMP9、HIF-1α和VEGF的mRNA和蛋白表达水平均降低,与五味子醇甲剂量呈负相关。结论1.五味子醇甲对人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的增殖及迁移具有抑制作用,且呈时间和剂量依赖性。2.五味子醇甲可能通过影响cyclinD1、CDK4和P21等基因的表达阻滞细胞周期进程,也可能通过调节Bcl-2家族基因的表达促进了SH-SY5Y细胞的凋亡,发挥抗增殖作用。3.五味子醇甲抑制SH-SY5Y细胞的迁移可能是通过抑制MMP9、HIF-1α和VEGF等基因的表达实现。
【学位单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R739.4
【部分图文】：

划痕实验,细胞,五味子醇甲

图3-8：细胞划痕实验后，连续观察3天，分别在24 h、48 h和72 h进行拍照。图A为镜下拍摄图为统计学分析结果。*p<0.05，**p<0.01。移相关的基因mRNA和蛋白的表达水平步明确五味子醇甲抑制SH-SY5Y细胞迁移可能机制，细胞分别、5 μM、10 μM、20 μM）的五味子醇甲培养72 h后，qRT-PCR和细胞中基质金属蛋白酶9（MMP9）、缺氧诱导因子（HIF-1α）VEGF）等基因的转录水平和蛋白表达水平。结果显示，与对照用组细胞中MMP9、HIF-1α和VEGF的mRNA和蛋白表达水平依赖性。p<0.05，差异显著，有统计学意义。

【参考文献】