Notch3基因G73A突变的致病性研究

发布时间：2020-09-19 10:29

　　研究背景在全球缺血性脑卒中患者中,大约25%由脑小血管疾病(cerebral small vessel disease,SVD)引起。在60岁以上人群中,超过50%患有脑小血管病。SVD累及的血管直径为30-800 μm,包括发生于小动脉、微动脉、毛细血管和小静脉的疾病。SVD以缺血性或出血性脑卒中和痴呆为特征,并可导致认知功能、步态和平衡能力的显著异常。在脑小血管疾病中,有大约5%为遗传性。其中,伴有皮质下梗死和白质脑病的常染色体显性遗传性脑动脉病(Cerebral autosomal dominant arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy,CADASIL)为最常见的单基因遗传性脑小血管病。尽管全球发病率未知,在英国,约每10万人中有4.15例患者,10.7名致病突变基因携带者,由于散发型患者的存在,实际患病率可能更高。经报道,CADASIL在65岁以下腔隙性梗死伴白质疏松的患者中占2%,在50岁以下患者中占11%。CADASIL是成年人中脑卒中与血管性痴呆的首要原因,以成年起病的先兆偏头痛,反复发作的皮质下脑缺血发作(transient ischemic attacks,TIA)或脑卒中,进行性认知损害以及精神障碍为主要特征。其中偏头痛与脑卒中通常为典型首发症状。然而CADASIL的临床表现在家族之间甚至家族内部都有较大差异,这些临床表现在不同年龄与不同病程中出现频率也有所不同。CADASIL的平均发病年龄为41岁(±9.2年),平均死亡年龄约为65岁,根据表型不同可早至30岁晚至80岁。CADASIL的典型的核磁共振成像(Magnetic resonance imaging,MRI)异常表现包括腔隙性梗死,扩大的血管间隙以及T2加权像脑白质的对称性高信号。其中,T2加权像的白质高信号最为常见,通常位于脑室周围以及白质深部,发生率与严重程度随年龄增长而显著增加。位于前颞叶、外囊的白质高信号可使CADASIL与散发型脑小血管病相鉴别。CADASIL影像学异常表现可早至20岁被检测到,致病突变基因携带者在35岁之后均有MRI异常表现。目前CADASIL治疗选择十分有限,包括对症治疗与二级预防措施。有文献表明SVD危险因素可能加速CADASIL症状进展,应该及时进行控制。CADASIL主要由位于染色体19p13.1上的Notch3基因突变引起。Notch3基因在全身小动脉平滑肌细胞(arterial smooth muscle cells,VSMCs)以及毛细血管周皮细胞中表达,,而只有脑血管病变引起临床症状。Notch3基因缺陷主要导致异常的动脉结构以及肌源性反应。其对血管的损伤主要以血管平滑肌细胞变性与减少,细胞外嗜锇样物质沉积,Notch3受体蛋白胞外段异常聚集,细胞外基质聚集导致纤维化为特征。Notch3编码单次跨膜的异二聚体受体,由34个表皮生长因子样重复序列(epidermal growth fac tor-l ike repeats,EGF-like repeats)组成的胞外段(extracellular domain,ECD),跨膜结构域,以及胞内段构成。每个EGF-like结构域包括6个高度保守的半胱氨酸残基,在Cl-C3,C2-C4和C5-C6半胱氨酸之间形成分子内二硫键,这种结构对于与配体结合来说至关重要。Notch3首先合成280kDa的前体形式,随后被furin成对碱性氨基酸蛋白酶通过SI蛋白水解作用形成细胞膜上的异二聚体受体。当Notch3受体与DSL(Delta/Serrate/Lag-2)配体相结合后,金属蛋白水解酶ADAM对其进行S2蛋白水解,使异二聚体释放210kDa的胞外段。脱落的胞外段随后被DSL配体细胞或原本的信号接收细胞所内吞。然后再在γ分泌酶(γ-secretase)的S3蛋白水解切割作用下,Notch3的胞内段释放,并转移至细胞核内,调控靶基因表达。迄今为止,Notch3基因上的的CADASIL致病突变已有超过300个突变位点被记录报道。绝大部分位于全部33个外显子中编码34个EGF样重复序列的2-24号外显子。95%的致病突变为错义突变,通常导致Notch3的半胱氨酸数目发生变化,个数增加或减少成为奇数,从而引起Notch3蛋白胞外域结构发生变化,错误折叠并聚集。这种异常二硫键的形成先前被认为影响与配体结合从而影响信号传导,然而对信号传导病理机制的研究结论不一,许多致病突变被发现并不影响Notch3信号传导。另外,在Notch3基因敲除小鼠中,Notch3的完全丧失并不会引起CADASIL的病理变化。这表明CADASIL的致病突变可能并不是损害原本Notch3的基本功能,而可能是新产生了细胞毒性作用。类似淀粉样沉淀炎性斑块在阿尔茨海默病中的致病作用机理,Notch3的胞外段异常聚集也被认为是CADASIL中的主要病理机制。研究者们发现了许多支持证据。首先,在CADASIL患者和转基因小鼠体内,Notch3的胞外段异常沉积发生在其他病理改变之前。另外,研究表明,突变型的Notch3相较于野生型的Notch3,有更易形成聚集体的倾向,并且更加不易降解。先前研究者通过体外培养CADASIL患者的平滑肌细胞发现了与蛋白降解与折叠相关蛋白的表达水平异常,表明了突变型Notch3可能引起内质网应激并激活未折叠蛋白反应。另一相关体外实验观察到,突变型Notch3聚集体在内质网的异常滞留导致细胞生长减少,并对蛋白酶体抑制等细胞压力更加敏感,最终导致细胞死亡。这些研究表明,致病突变引起Notch3的错误折叠以及多聚化。到目前为止,一些非半胱氨酸的CADASIL致病突变也被陆续报道,并有研究发现一些非半胱氨酸型的致病突变与半胱氨酸型的致病突变类似,也可引起Notch3的结构改变。并且,一些非半胱氨酸型的致病突变也同样有Notch3蛋白聚集倾向。我们于临床收治了一名具有CADASIL典型临床表现的患者,具体表现为青年起病的反复偏头痛发作,多次腔隙性梗死,抑郁和焦虑障碍,以及与病情严重程度不相符的心血管危险因素如糖耐量异常与高血压1级。MRI表现为T2加权像下弥漫性双侧对称脑白质深部高信号,以及白质高信号区、基底节与脑干的多发腔隙性梗死。行NOTCH3全外显子基因筛查时发现c.218GC杂合突变,该位点未经报导。此突变致使73位氨基酸的甘氨酸变为丙氨酸(p.G73A),我们拟就该突变位点进行体外探究实验以证实其致病性。研究目的本研究主要探讨了 CADASIL的发病机理,明确新发现的CADASIL相关c.218GC NOTCH3基因突变的致病性。研究方法1.p.G73A的分子遗传学分析1.1对Notch3第73位氨基酸进行分子内EGF样重复序列间的遗传保守性分析。1.2对Notch3第73位氨基酸进行物种间进化保守性分析。2.准备野生型Notch3EKD表达质粒和c.218GC突变型Notch3ECD表达质粒2.1于addgene购买Notch3ECD表达质粒,进行质粒扩增纯化,及测序验证。2.2对Notch3ECD表达质粒进行单位点诱导突变,进行质粒扩增并测序验证。3.探索Notch3ECD在HEK293T细胞的表达分布3.1利用野生型Notch3ECD与突变型Notch3ECD表达质粒对HEK293T细胞进行脂质体转染。3.2培养48h后,Notch3ECD特异性鼠单克隆抗体4℃孵育过夜,Alexa Fluor 488荧光二抗室温孵育lh,在共聚焦显微镜下观察过表达的Notch3ECD在细胞中分布。4.探究p.G73A突变型Notch3ECD对HEK293T细胞活力的影响4.1 HEK293T细胞分别转染野生型Notch3ECD与突变型Notch3ECD表达质粒以及阴性对照质粒pcDNA4,培养48h后进行CCK8实验4.2 HEK293T细胞分别转染野生型Notch3ECD与突变型Notch3ECD表达质粒以及阴性对照质粒pcDNA4,培养48h后进行ATP发光法细胞活力检测实验5.探究p.G73A突变型Notch3ECD对细胞凋亡的影响HEK293T细胞分别转染野生型Notch3ECD与突变型Notch3ECD表达质粒以及pcDNA4阴性对照质粒,培养48h后对其进行annexinV-FITC/PI双染,利用流式细胞学实验检测每组凋亡率。研究结果1.Notch3第73位甘氨酸在分子内EGF样重复序列间具有保守性。在Notch3 34个EGF样重复序列中,除第17个EGF样结构域外,都呈高度保守。2.Notch3第73位甘氨酸在物种间具有高度进化保守性。Notch3第73位氨基酸在Notch3二硫键环中的位置在非人灵长类、啮齿类动物至鱼类中都具有高度进化保守性。在人和啮齿类动物中位于C5-C6二硫键环之间,在其余的物种位于唯一的EGF-1 ike结构域中。3.p.G73A突变型Notch3ECD可降低HEK293T细胞活力3.1在CCK8实验中,转染了突变型Notch3HEKD表达质粒的HEK293T细胞较阴性对照组细胞活力明显降低。转染了野生型Notch3ECD表达质粒的HEK293T细胞较阴性对照组细胞活力无明显变化。3.2在ATP细胞活力检测实验中,转染了突变型Notch3ECD表达质粒的HEK293T细胞较阴性对照组细胞活力明显降低。转染了野生型Notch3ECD)表达质粒的HEK293T细胞较阴性对照组细胞活力无明显变化。4.p.G73A突变型Notch3ECD促进HEK293T细胞凋亡annexinV-FITC/PI双染流式细胞学实验结果表明,转染了突变型Notch3ECD表达质粒的HEK293T细胞较阴性对照组细胞凋亡率明显增加。转染了野生型Notch3ECD表达质粒的HEK293T细胞较阴性对照组细胞凋亡率无明显变化。结论1.Notch3第73位甘氨酸在分子内EGF样重复序列间以及物种间具有高度遗传保守性。2.p.G73A突变型Notch3ECD可通过促进细胞凋亡影响细胞活力。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R743
【部分图文】：

序列,重复序列,物种

图１．１．２邋ＮＯＴＣＨ３的ＥＧＦ重复序列间对比。方框所示为Ｇｌｙ７３在各个ＥＧＦ结构逡逑域的对应位点。逡逑１．２邋ＮＯＴＣＨ３第７３位甘氨酸在不同物种间的保守性分析逡逑接着我们又研究了该位点在不同物种间的保守性。我们利用Ｊａｌｖｉｅｗ软件分逡逑析了各个物种的第一邋ＥＧＦ结构域的相应序列。研究发现，该位点从灵长类、啮逡逑齿类到两栖类乃至鱼类都呈现出高度进化保守性。该位点在人类，小鼠与大鼠中逡逑位于Ｃ５－Ｃ６半胱氨酸二硫键环之间，在其余物种则位于第一邋ＥＧＦ结构域唯一的二逡逑硫键环之间（图１．１．３邋）。各物种Ｎ０ＴＣＨ３序列均来自Ｕｎｉｐｒｏｔ数据库逡逑（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）逡逑

序列,物种,结构域,位点

逑结构域间的位点保守性。我们发现，除了第１７个ＥＧＦ结构域外，该位点在其余逡逑所有ＥＧＦ结构域都高度保守（图１．１．２）。逡逑，逦ｃ逦ｌｏｏｐ邋——，逡逑Ｃ４－Ｃ６邋ｉｎ邋ＥＧＦ－ｌｉｋｅ邋ｒｅｐｅａｔｓ邋ｏｆ邋Ｈｕｍａｎ邋Ｎ０ＴＣＨ３邋ＡＣ４ＬＣ５ＰＰＧＷ邋Ｖ｜ｇ｜Ｅ邋Ｒ邋Ｃ邋６邋Ｑ邋Ｌ邋Ｅ邋Ｄ逡逑ＥＧＦ－ｌｉｋｅ邋Ｄｏｍａｉｎ邋１－５，７－１６，１８－２４，２６－３１，３３－３４逦＊Ｃ４＊Ｃ５＊＊Ｇ逦l:l:邋Ｇ＊＊Ｃ６＊＊＊＊逡逑ＥＧＦ－ｌｉｋｅ邋Ｄｏｍａｉｎ邋１７逦＊邋Ｃ邋４邋＊邋Ｃ邋５邋＊逦＊邋Ｇ逦＊邋＊邋＊邋＊邋＊邋Ｃ邋６邋＊邋＊邋＊邋＊逡逑ＥＧＦ－ｌｉｋｅ邋Ｄｏｍａｉｎ邋６，２５，３２逦＊Ｃ４＊Ｃ５＊逦l:l:逦l:l:邋Ｃ６＊＊＊＊逡逑图１．１．２邋ＮＯＴＣＨ３的ＥＧＦ重复序列间对比。方框所示为Ｇｌｙ７３在各个ＥＧＦ结构逡逑域的对应位点。逡逑１．２邋ＮＯＴＣＨ３第７３位甘氨酸在不同物种间的保守性分析逡逑接着我们又研究了该位点在不同物种间的保守性。我们利用Ｊａｌｖｉｅｗ软件分逡逑析了各个物种的第一邋ＥＧＦ结构域的相应序列。研究发现，该位点从灵长类、啮逡逑齿类到两栖类乃至鱼类都呈现出高度进化保守性。该位点在人类，小鼠与大鼠中逡逑位于Ｃ５－Ｃ６半胱氨酸二硫键环之间，在其余物种则位于第一邋ＥＧＦ结构域唯一的二逡逑硫键环之间（图１．１．３邋

野生型,高灵敏度,显微镜,转染

ｐＧ７３Ａ－ＮＯＴＣＨ３－ｂｉｏ－Ｈｉｓ邋分别转染邋ＨＥＫ２９３Ｔ邋细胞，４８ｈ邋后用邋ＮＯＴＣＨ３邋特异性抗逡逑体作为一抗，Ａｌｅｘａ邋Ｆｌｕｏｒ邋４８８作为二抗进行孵育，用１０ｘ６３的高灵敏度激光共聚逡逑焦显微镜进行观察。如图３所示，Ｎ０ＴＣＨｅｃｄ主要分布于细胞质中。相较野生型，逡逑Ｇ７３Ａ在核周有颗粒样的密集分布，而野生型相比而言分布较均匀。逡逑２９逡逑

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