自噬在缺血缺氧致神经SH-SY5Y细胞损伤中的作用

发布时间：2020-09-19 10:39

　　 背景脑血管病严重威胁人类健康,其中脑卒中是最常见的脑血管病。目前在我国,因脑卒中导致的死亡已占死亡原因的首位,我国人口老龄化日益加剧,脑卒中必将成为威胁老年人健康的主要杀手。脑卒中患者中缺血性脑卒中居多。缺血性脑卒中发生时,脑组织缺血中心区神经组织很快因缺血缺氧而发生不可挽回的梗死,但在缺血中心区周围的缺血半暗带区神经组织只是部分缺血缺氧,在一定时间内只是处于病理损伤的早期阶段,其中的神经元多呈现细胞水样变性,既有加重死亡的趋势,又有逆转恢复正常的可能。因此,寻找神经细胞自我保护机制,延长半暗带区细胞存活时间,适当扩大治疗时间窗,为患者后续治疗赢得时间是目前亟待解决的实际问题。近年来许多研究表明,自噬作为一种细胞自救机制,在生理和应激条件下都发挥着重要作用。但缺血时自噬的作用机制不明确,发挥促进存活还是加剧损伤作用也存在争议。神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y作为体外细胞模型用来研究神经元损伤是学术界公认的,因此,本课题选用SH-SY5Y作为体外细胞模型,模拟缺血半暗带的缺氧缺糖环境,通过观察细胞微丝、线粒体变化,检测细胞凋亡、坏死、自噬情况,全面反映神经细胞的损伤变化,揭示神经元自我救赎机制,为临床上进一步扩大缺血性脑卒中治疗时间窗、促进康复提供实验依据。目的研究在缺血缺氧条件下神经细胞SH-SY5Y的损伤情况,观察Beclin1蛋白在缺血缺氧条件下对神经元自噬的作用以及对细胞抗损伤的影响;观察线粒体变化与神经元自噬的关系以及在缺血缺氧致SH-SY5Y细胞损伤中的作用;观察微丝变化与神经元抗损伤活动的关系,以期寻找影响神经细胞自救的因素,为保护半暗带神经元提供依据。方法采用神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y进行培养,糖氧剥夺(OGD)模拟半暗带区缺血缺氧环境,应用RNA干扰(RNAi)技术构建Beclin1-siRNA干扰模型,下调Beclin1的转录和翻译水平,从而下调自噬。观察缺血缺氧对SH-SY5Y损伤的实验,具体分为三组:对照组、OGD 6 h组、OGD 24 h组。观察自噬在缺血缺氧SH-SY5Y损伤中的作用,具体实验分为四组:对照组、RNAi组、OGD 6 h组以及RNAi+OGD 6 h组。RT-PCR、Western Blot法对Beclin1-siRNA干扰模型进行鉴定;采用CCK-8法检测细胞活力;微板比色法检测细胞培养上清液中乳酸脱氢酶(LDH)含量;特异性荧光探针标记细胞微丝、线粒体,荧光显微镜下观察微丝皮质层、应力纤维变化,线粒体分布、数量和形态改变;DCFH-DA荧光探针标记活性氧(ROS),流式细胞仪、荧光显微镜观察ROS变化;间接免疫荧光标记LC3蛋白,Western Blot检测Beclin1、LC3、P62自噬相关蛋白,评价细胞自噬情况;Hoechst33258/PI观察细胞坏死情况;DAPI染色和Annexin V-FITC/PI分别观察细胞核形态、检测细胞凋亡水平,Bcl-2、Bax凋亡相关蛋白表达情况采用Western Blot检测。结果1.缺血缺氧条件下神经细胞SH-SY5Y的变化与对照组相比随OGD时间延长,细胞的活力逐渐下降,LDH溢出逐渐增多;OGD 6 h组较对照组细胞微丝皮质层变薄,应力纤维减少,OGD 24 h后微丝损伤加重甚至出现凝集现象;线粒体总数减少,呈线状的线粒体减少,呈点状的线粒体增多,绕细胞核周分布;流式细胞术、荧光显微镜结果均显示随OGD时间延长,细胞内ROS水平逐渐升高;OGD处理后Beclin1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ相对增多,反映自噬降解水平的P62表达下降,免疫荧光结果同样显示LC3-Ⅱ亮点增多,OGD后自噬水平上调且自噬流通畅;Hoechst33258/PI双染结果显示,与对照组相比OGD后细胞呈现亮蓝色、红染,说明坏死细胞增多;凋亡方面,经DAPI染色后OGD 6 h组的细胞核染色质边缘凝集,OGD 24 h后形态变化更加明显,从整体上检测细胞凋亡率显示OGD时间延长细胞凋亡率逐渐增加。2.Beclin1-siRNA转染效果检验Beclin1-siRNA干扰后基因水平和蛋白水平检测均显示,Beclin1水平明显下调,干扰成功。3.RNAi下调Beclin1水平缺血缺氧条件下SH-SY5Y的变化RNAi+OGD 6 h组与OGD 6 h组相比,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ明显减少,P62增多,自噬水平显著下调,但RNAi+OGD 6 h组自噬水平仍高于对照组;较OGD 6 h组,RNAi+OGD 6 h组细胞的活力下降明显,线粒体数量减少,微丝皮质层变薄,应力纤维进一步减少,坏死细胞增多,细胞凋亡率增加,Bax明显增多,Bcl-2减少。结论缺血缺氧导致神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y发生损伤;Beclin1依赖的自噬对缺血缺氧神经细胞SH-SY5Y具有保护作用。
【学位单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R743
【部分图文】：

-1 OGD 不同时间对 SH-SY5Y 细胞 LDH 溢出的培养上清液中 LDH 的含量；* P <0.05 与对照组对细胞微丝形态的影响常进行都有赖于细胞骨架的完整性，而微的皮质层、应力纤维以及伪足，为细胞内，微丝及微丝相关蛋白被氧化修饰，解聚图 3-2 中所示，对照组皮质层完整，细胞理 6 h 后 SH-SY5Y 细胞皮质层变薄，应层、应力纤维进一步减少，甚至消失。结破坏，神经细胞 SH-SY5Y 损伤加剧。

图 3-1 OGD 不同时间对 SH-SY5Y 细胞 LDH 溢出的影响注：微板比色法检测细胞培养上清液中 LDH 的含量；* P <0.05 与对照组相比（n=3, x ± s）。3.1.3 缺血缺氧对细胞微丝形态的影响许多细胞活动的正常进行都有赖于细胞骨架的完整性，而微丝是细胞骨架的重要组成部分，用于形成细胞的皮质层、应力纤维以及伪足，为细胞内运输提供动力和交通线路。当细胞受到损伤时，微丝及微丝相关蛋白被氧化修饰，解聚与聚合平衡打破，微丝结构和功能被破坏。如图 3-2 中所示，对照组皮质层完整，细胞内应力纤维弥散分布，与之相比，经 OGD 处理 6 h 后 SH-SY5Y 细胞皮质层变薄，应力纤维减少，OGD 处理24 h 后微丝凝集，皮质层、应力纤维进一步减少，甚至消失。结果表明，随着缺血缺氧时间延长，细胞微丝被破坏，神经细胞 SH-SY5Y 损伤加剧。

因此检测细胞内线粒体的状态在一定程度上反映了细胞的损伤情况。采用不依赖于线粒体膜电位的活细胞线粒体特异性荧光染料进行染色，如图 3-3 所示，绿色荧光即为线粒体，由图中可以看到，对照组线粒体在细胞质弥散分布，多呈线状；经 OGD处理 6 h 的神经细胞 SH-SY5Y 绿色荧光减少，呈现绕核分布，多为点状，处理 24 h 后绿色荧光进一步减少，核周分布更加明显。结果显示，随着缺血缺氧时间延长，线粒体数量减少，分离增多，细胞发生损伤。

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 王思语;;夏季养胃,防患于“胃”然[J];康颐;2016年08期

2 钱伟;;老人突发疾病怎么办[J];黄河.黄土.黄种人;2016年23期

3 ;五成脑中风患者发生在秋冬季 切莫忽视“中风”预警信号[J];家庭医药.快乐养生;2016年11期

4 ;五成脑中风患者发生在秋冬季 切莫忽视“中风”预警信号[J];家庭医药.就医选药;2016年11期

5 旷惠桃;;“倒春寒”来袭 须防三类疾病[J];老年人;2017年03期

6 胡强;陈高;;缺氧诱导因子-1α在缺血缺氧脑损伤中的作用研究进展[J];国际神经病学神经外科学杂志;2013年03期

7 彭静;林国生;;缺血缺氧对骨髓间充质干细胞凋亡的影响[J];武汉大学学报(医学版);2008年01期

8 周军利;黄跃生;党永明;张琼;;甘氨酸对缺血缺氧心肌细胞能量代谢的影响[J];现代生物医学进展;2008年06期

9 司国英;;自溢后缺血缺氧综合征3例抢救护理体会[J];医学综述;2007年23期

10 李湘云;程书卿;;缺血缺氧动物实验模型制作分析[J];中国实用神经疾病杂志;2006年05期

相关会议论文 前10条

1 孙保存;张丹芳;张诗武;郭华;张文治;赵秀兰;;缺血缺氧对黑色素瘤局部浸润的相关分子机制影响的初步研究[A];中华医学会病理学分会2006年学术年会论文汇编[C];2006年

2 林晓燕;梁艳苓;陈翔;张姿英;汤行录;汤春萍;陈调和;;新生大鼠缺血缺氧脑损伤早期认知功能改变的研究[A];第六届江浙沪儿科学术会议暨儿科学基础与临床研究进展学术班论文汇编[C];2009年

3 张海英;劳梅丽;张全鹏;;原儿茶酸对缺血缺氧脑损伤的保护作用研究[A];中国解剖学会2012年年会论文文摘汇编[C];2012年

4 林晓燕;梁艳苓;陈翔;张姿英;汤行录;汤春萍;陈调和;;新生大鼠缺血缺氧脑损伤早期认知功能改变的研究[A];2008年浙江省儿科学学术年会论文汇编[C];2008年

5 林晓燕;梁艳苓;陈翔;张姿英;汤行录;汤春萍;陈调和;;新生大鼠缺血缺氧脑损伤早期认知功能改变的研究[A];第三届全国儿童康复学术会第十届全国小儿脑瘫学术研讨会论文汇编[C];2008年

6 林晓燕;梁艳苓;陈翔;张姿英;汤行录;汤春萍;陈调和;;新生大鼠缺血缺氧脑损伤早期认知功能改变的研究[A];浙江省医学会围产医学分会成立大会暨“围产医学热点问题”学术会议论文汇编[C];2008年

7 黄跃生;;烧伤早期心肌损害——休克和缺血缺氧的重要启动因素?[A];第五届全国烧伤救治专题研讨会烧伤后脏器损害的临床救治论文汇编[C];2007年

8 周军利;黄跃生;宋华培;党永明;张琼;;甘氨酸对缺血缺氧心肌细胞凋亡的影响[A];第八届西南五省一市烧伤整形学术会议暨贵州省医学会烧伤整形分会2010年学术年会论文汇编[C];2010年

9 黄跃生;;烧伤早期心肌损害—休克和缺血缺氧的重要启动因素[A];浙江省第十七届烧伤外科学学术会议论文汇编[C];2007年

10 周军利;黄跃生;宋华培;党永明;张琼;;甘氨酸对缺血缺氧心肌细胞凋亡的影响[A];中华医学会烧伤外科学分会2009年学术年会论文汇编[C];2009年

相关重要报纸文章 前10条

1 成都军区总医院临床营养科副主任医师 林宁;中午吃太饱 瞌睡虫上脑[N];健康报;2017年

2 ;自体干细胞注射可恢复心脏功能[N];新华每日电讯;2003年

3 记者 陆静 通讯员 王昌文;西南医院烧伤基础研究取得重要进展[N];中国中医药报;2004年

4 王昌文;我国烧伤基础研究取得重要进展[N];光明日报;2005年

5 福建 何孝炎;老年人的夜间保健[N];家庭医生报;2003年

6 白轶南;老烟民易患脉管炎[N];健康时报;2007年

7 北京友谊医院主任医师王润华;春捂秋冻 未必人人宜[N];中国医药报;2002年

8 范秀华 河北医科大学第二医院妇产科;重视妊娠高血压综合征[N];中国中医药报;2016年

9 湖北武昌 张爱军 教授;老人冷天起夜要三“防”[N];保健时报;2003年

10 副教授 黄文斌;也许，不仅仅是阑尾炎[N];大众卫生报;2001年

相关博士学位论文 前10条

1 罗海彦;蛋白多糖在脑组织细胞缺血缺氧炎性反应信号转导的作用及其调控机理的实验研究[D];重庆医科大学;2006年

2 杨超;磁共振活体评价AQP4基因沉寂治疗早期缺血缺氧性脑损伤[D];大连医科大学;2015年

3 庞继恩;线粒体偶联因子6在心肌梗死中的临床意义及其机制研究[D];华中科技大学;2008年

4 孙欣;缺血缺氧性脑损伤后分子伴侣发育依赖性调节的研究[D];吉林大学;2016年

5 宋华培;PI3K/Akt信号途径抑制缺血缺氧心肌细胞凋亡及其机制研究[D];第三军医大学;2007年

6 周军利;甘氨酸膜受体途径对严重烧伤大鼠心肌保护效应及机制研究[D];第三军医大学;2008年

7 石贞玉;自噬对神经性缺血缺氧的保护作用-Wnt/β-catenin信号通路负性介导[D];河南大学;2016年

8 林欣潮;不同中医证型ASO患肢缺血缺氧水平与血管生成的相关性研究[D];北京中医药大学;2012年

9 张磊;缺血缺氧脑损伤大鼠模型及缺血缺氧诱发的纹状体和CA1多巴胺信号的在体实时电化学记录研究[D];中国协和医科大学;2007年

10 于玮玮;体外震波在缺血缺氧诱导的H9c2细胞凋亡中的作用研究[D];北京协和医学院;2014年

相关硕士学位论文 前10条

1 王萌;自噬在缺血缺氧致神经SH-SY5Y细胞损伤中的作用[D];河南大学;2019年

2 魏炜;基于PI3K/Akt/mTOR信号通路研究氧化苦参碱对新生大鼠缺血缺氧脑损伤的保护作用[D];宁夏医科大学;2019年

3 吕若宁;不同温度停循环对神经细胞表达小泛素样蛋白影响的离体实验研究[D];北京协和医学院;2018年

4 李晓东;机械牵张加重缺血缺氧心肌细胞损伤的效应及其机制研究[D];第三军医大学;2004年

5 刘伟;缺血缺氧对新生小鼠脑组织病理学改变的实验研究[D];新疆医科大学;2008年

6 卢先锋;新生大鼠缺血缺氧性脑损伤HSP70的合成及与细胞凋亡的关系[D];山西医科大学;2006年

7 武师润;新生大鼠缺血缺氧性脑损伤COX-2的合成及与细胞凋亡的关系[D];山西医科大学;2007年

8 国瑞婧;心肌细胞缺血缺氧与室性心律失常的关系的研究[D];重庆医科大学;2014年

9 杨峰霞;环磷腺苷葡胺和氨茶碱对新生大鼠缺血缺氧性脑损伤的干预作用[D];南方医科大学;2009年

10 刘婵;缺血缺氧对脑组织和小胶质细胞的损伤机制及通心络的干预作用[D];河北医科大学;2016年

本文编号：2822407