P2X4受体拮抗剂5-BDBD对小胶质细胞中NLRP3炎性小体活化的影响

发布时间：2020-09-23 12:08

　　目的由于人口老龄化的原因,神经退行性疾病的发病率和致残率越来越高,在社会经济方面产生了相当大的影响,越来越多的证据表明,帕金森病(PD)、阿尔茨海默病(AD)和肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)等神经退行性疾病的发病机制不仅涉及到神经元,而且还与中枢神经系统(CNS)的免疫反应有很大的关系,特别是小胶质细胞.本文旨在探讨受体拮抗剂5-BDBD对小胶质细胞中NLRP3炎性小体活化的影响。方法取处于对数生长期的BV2小胶质细胞用于实验,采用脂多糖(LPS)+三磷酸腺苷(ATP)双信号干预,建立NLRP3炎性小体活化的模型。按照不同干预方法将BV2小胶质细胞分为8组:正常对照组、ATP组、LPS组、LPS+ATP组、5-BDBD组、ATP+5-BDBD组、LPS+5-BDBD组和LPS+ATP+5-BDBD组。应用CCK-8法检测LPS和ATP对BV2细胞活力的影响,以为后续实验选取适宜的药物浓度;Real time PCR检测各组NLRP3、P2X4 mRNA表达水平;Western blot技术测定P2X4、NLRP3、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(caspase-1)的蛋白表达水平;酶联免疫吸附法(ELISA)法测定细胞上清液中IL-1β释放水平。结果如下:1.CCK-8的结果显示1μg/m L的LPS以及0-1mmol/L的ATP浓度均不影响BV2细胞的活力(P0.05),而2mmol/L以上的ATP浓度则对BV2细胞的存活率产生影响,我们选取的2mmol/L、3mmol/L、5mmol/L的ATP浓度组BV2细胞的活力均较对照组偏低,差异均具有统计学意义(P0.05,P0.001,P0.001)。虽然2mmol/L的ATP浓度对细胞出现了损伤作用,影响了细胞的活力(79.52±3.873%),但是通过我们后续的预试验以及阅读大量文献,证明2mmol/L以下的ATP浓度和LPS共同作用不能很好的激活下游通路,而2mmol/L的ATP和1μg/mL的LPS具有较好的相容性,也能很好的激活其下游通路,因此,我们选取了1μg/mL的LPS、2mmol/L的ATP作为后续实验的药物浓度。2.Real time PCR结果显示,与对照组相比较,LPS组和LPS+ATP组的NLRP3mRNA水平均明显增高,差异均具有统计学意义(P0.001,P0.001),并且与LPS组相比,LPS+ATP组的NLRP3 mRNA水平升高,差异有统计学意义(P0.05);和对照组相比较,加入2mmol/L的ATP处理BV2细胞3 h后,其P2X4 mRNA表达明显增加,差异具有显著统计学意义(P0.001)。3.Western blot检测结果表明,与对照组相比,在加入2mmol/L的ATP处理3 h后,BV2细胞中的P2X4蛋白表达明显增加,差异有显著统计学意义(P0.001);和对照组相比,LPS+ATP双信号处理BV2细胞后NLRP3蛋白水平明显升高,差异具有统计学意义(P0.001),而单独用LPS或ATP处理的BV2细胞中NLRP3蛋白水平与对照组相比没有统计学意义(P0.05);和对照组比较,LPS组和ATP组中caspase-1(P10)蛋白水平的变化没有统计学意义(P0.05),LPS+ATP组的caspase-1(P10)蛋白表达水平明显增加,差异有统计学意义(P0.001),但是在加入P2X4受体拮抗剂5-BDBD后结果提示,LPS+ATP+5-BDBD组的caspase-1(P10)蛋白表达水平较LPS+ATP组明显减少,差异有统计学意义(P0.001)。4.用ELISA法检测各组细胞上清液中IL-1β的含量,结果提示,与对照组相比,LPS组和ATP组上清液中IL-1β含量的变化没有统计学意义(P0.05),LPS+ATP双信号处理BV2细胞后,上清液中IL-1β的含量显著增加,差异有统计学意义(P0.01),但是在加入P2X4受体拮抗剂5-BDBD后结果提示,与LPS+ATP组相比较,LPS+ATP+5-BDBD组上清液中IL-1β的含量明显减少,差异有统计学意义(P0.05)。结论P2X4受体拮抗剂5-BDBD能够抑制LPS+ATP双信号激活BV2细胞中NLRP3炎性小体后的炎性效应,包括caspase-1(P10)的活化及IL-1β的的产生,这将为神经退行性疾病的抗炎治疗提供新的思路。
【学位单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R741
【部分图文】：

细胞活力,细胞的,活力,浓度

高浓度的 ATP（mmol/L 以上）可以通过与其特异性配体（嘌呤外的离子平衡，引起细胞损伤甚至凋亡。此时，细胞的存活。为了进一步确定 BV2 细胞和我们实验所用药物的相容性，适的药物浓度，我们用不同浓度的 ATP 作用于 BV2 细胞（ LPS 的浓度为 1μg/mL），采用 CCK-8 法测定各组的细胞活细胞活力及细胞存活率是 100%。CCK-8 的结果显示 1μg/mLol/L 的 ATP 浓度不影响 BV2 细胞的活力，而 2mmol/L 以上2 细胞的存活率产生影响，我们选取的 2mmol/L、3mmol/L、组 BV2 细胞的活力均较对照组低，差异均具有统计学意义（<0.001）。虽然 2mmol/L 的 ATP 浓度对细胞出现了损伤作用力(79.52±3.873%), 但是通过我们后续的预试验以及阅读大/L 以下的 ATP 浓度和 LPS 共同作用不能很好的激活下游通 ATP 和 1μg/mL 的 LPS 具有较好的相容性，也能很好的激活通路，因此，我们选取 1μg/mL 的 LPS、2mmol/L 的 ATP 作浓度（图 1）。

水平变化,统计学意义,小胶质细胞,表达水平

结果S 和 ATP 对各组 NLRP3 mRNA 水平的影响对照组相比较，LPS 组以及 LPS+ATP 组的 NLRP3 mRNA 水平异均具有统计学意义(P<0.001，P<0.001)；与 LPS 组相比较，LRP3 mRNA 水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)。表明 TP 干预都能使 BV2 小胶质细胞 NLRP3 mRNA 表达水平上调(

统计学意义,对照组,小胶质细胞,表达水平

图 3 Western blot 检测各组 NLRP3 蛋白水平变化( x ±S.E.M，n=3)ig 3 Expression of NLRP3 protein in each group using Western blot ( ±S.E.M，与对照组比较，***P<0.001。s： ATP=adenosine triphosphate ； LPS=lipopolysaccharide ； NLRP3=NOD-like receptor proteipared with control group，***P<0.001.LPS 和 ATP 对各组 caspase-1（P10）蛋白水平的影响Western blot 检测结果表明，和对照组比较，LPS+ATP 组的 caspase-1（P表达水平明显增加，差异有统计学意义(P<0.001)，而 LPS 组和 ATP pase-1（P10）蛋白水平与对照组相比均没有统计学意义（P>0.05），+ATP 共同作用可以使 BV2 小胶质细胞 pro-caspase-1 活化为 caspase-（1 4)。

【相似文献】