Alpha-突触核蛋白对小鼠SN及VTA区铁代谢的影响研究

发布时间：2020-09-25 17:57

　　 帕金森病(Parkinson’s disease,PD)的主要病理特征为中脑黑质(substantia nigra,SN)区多巴胺(dopamine,DA)能神经元丢失,残存神经元内出现以Alpha-突触核蛋白(alpha-synuclein,α-syn)为主要成分的路易小体(Lewy bodies,LBs),纹状体(striatum,Str)区DA释放减少。其主要临床表现有运动症状,包括:震颤麻痹、肌僵直、运动迟缓和姿势反射障碍等,大多数的PD病人还会伴有焦虑、抑郁、嗅觉障碍和便秘等非运动症状。通常非运动症状的出现会早于运动症状几年甚至十几年。虽然炎症、蛋白质异常聚集、SN区铁沉积、线粒体功能障碍、氧化应激和凋亡等均与PD发病有关,但确切发病原因与机制尚不完全清楚。因此,确定PD的病因,研究出相应的防治策略,对治疗PD或延缓PD的进程显得尤为重要。α-syn是由140个氨基酸组成并广泛存在于突触前神经元中。研究表明,α-syn能够促进DA的合成、参与囊泡的形成与转运以及神经递质稳态与释放的调节等。另外,异常聚集与突变的α-syn参与了PD的发病,α-syn也是第一个发现的与PD发病有关的蛋白。研究发现,α-syn的异常聚集通常伴随着铁的沉积。本实验室前期研究已证实SN区铁含量的升高能够造成DA能神经元的死亡,铁能够加速α-syn的聚集。二价金属离子转运蛋白(divalent metaltransporter 1,DMT1)是铁转入蛋白,而铁转运蛋白1(ferroportin 1,FPN1)是目前已知的唯一的跨膜铁转出蛋白。SN区铁含量的增高与DMT1蛋白表达的升高和FPN1蛋白表达的降低有关,同时,DMT1和FPN1蛋白表达的变化受铁调节蛋白1(iron regulatory protein 1,IRP1)的调控。PD病人中DA能神经元的缺失主要发生在SN区,而DA能神经元同样富集的腹侧中脑被盖区(ventral tegmental area,VTA)却无明显变化。本实验室在PD小鼠模型中发现,铁沉积特异性出现在SN区而VTA区并无铁沉积,α-syn聚集体出现在SN区而VTA区未见α-syn聚集体。为探究在体状态下α-syn对SN和VTA区铁代谢的影响,我们利用腺相关病毒介导的α-syn分别注射到小鼠的SN和VTA区,4周后通过酶联免疫吸附测定、蛋白质免疫印迹实验、免疫组织化学和免疫荧光实验检测小鼠SN、Str和VTA区α-syn含量和酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)表达的变化,利用Perls’铁染色技术检测SN和VTA区铁阳性细胞数目的变化,通过电感耦合等离子体质谱技术(Inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS)检测小鼠SN和Str区总铁含量的变化,通过爬杆测试检测小鼠运动速度的变化,转棒测试检测小鼠运动协调能力的改变,通过旷场测试分别检测小鼠自发运动总距离的变化和小鼠焦虑程度的变化。实验结果如下:(一)SN区过表达α-syn实验结果1.小鼠SN区注射α-syn 4周后,与对照组相比,α-syn组小鼠SN区人源α-syn含量增加,差异有统计学意义(P0.01,n=6),TH蛋白表达明显降低,差异有统计学意义(P0.001,n=6),TH阳性细胞数目减少,差异有统计学意义(P0.01,n=6);Str区α-syn蛋白表达水平显著增加,差异有统计学意义(P0.05,n=6),TH蛋白表达明显降低,差异有统计学意义(P0.001,n=6)。2.小鼠SN区注射α-syn 4周后,通过转棒实验发现,与对照组相比,α-syn组小鼠在旋转棒上停留时间明显降低,差异有统计学意义(P0.01,n=10);通过爬杆实验结果发现,与对照组相比,α-syn组小鼠调头时间与爬杆总时间均明显增加,差异有统计学意义(P0.01,n=9-10);旷场实验结果表明,与对照组小鼠相比,α-syn组小鼠自发运动距离明显降低,差异有统计学意义(P0.05,n=9)。3.小鼠SN区注射α-syn 4周后,通过旷场实验中小鼠在中间区域与外周区域的所处时间比值发现,与对照组相比,α-syn组小鼠焦虑程度明显上升,差异有统计学意义(P0.05,n=10)。4.小鼠SN区注射α-syn 4周后,运用ICP-MS检测结果表明,与对照组相比,α-syn组小鼠SN区总铁水平增加,差异有统计学意义(P0.01,n=6),SN区铁染色阳性细胞数明显增加,差异有统计学意义(P0.001,n=6);α-syn组小鼠Str区总铁水平增加,差异有统计学意义(P0.001,n=6)。5.小鼠SN区注射α-syn 4周后,与对照组相比,α-syn组小鼠SN区DMT1蛋白表达上升,差异有统计学意义(P0.05,n=6),FPN1蛋白表达下降,差异有统计学意义(P0.05,n=6),IRP1蛋白表达上调,差异有统计学意义(P0.05,n=6);与对照组相比,α-syn组小鼠Str区FPN1蛋白表达下调,差异有统计学意义(P0.05,n=6)。(二)VTA区过表达α-syn实验结果1.小鼠VTA区注射α-syn 4周后,与对照组小鼠相比,α-syn组小鼠VTA区TH阳性细胞数明显降低,差异有统计学意义(P0.01,n=6)。2.小鼠VTA区注射α-syn 4周后,与对照组小鼠相比,α-syn组小鼠VTA区铁阳性细胞数目无明显变化,差异没有统计学意义(P0.05,n=6)。3.小鼠VTA区注射α-syn 4周后,与对照组小鼠相比,α-syn组小鼠VTA区DMT1阳性细胞数目无明显变化,差异没有统计学意义(P0.05,n=6)。以上实验结果提示,SN区过表达α-syn会导致小鼠SN区DA能神经元受损,小鼠运动速度和运动协调能力受损,SN与Str区总铁水平增加。其铁水平增加可能是与DMT1表达的增多加快了铁的转入,FPN1表达的降低减少了铁的转出有关,而DMT1和FPN1表达的变化可能受IRP1的调节。VTA区过表达α-syn会导致小鼠VTA区DA能神经元受损,不会引起铁水平的增加和DMT1表达的增加。综上所述,SN区过表达α-syn能够引起SN区铁的沉积,而VTA区α-syn过表达不会影响VTA区铁水平,其可能与某些铁转运相关蛋白在SN和VTA区表达不同有关。
【学位单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R742.5
【文章目录】：
摘要
abstract
引言
材料和方法
    1 动物准备
    2 实验方法
        2.1 动物行为学测试
        2.2 铁染色
        2.3 免疫组织化学检测
        2.4 免疫荧光检测
        2.5 蛋白质免疫印迹实验
        2.6 电感耦合等离子体质谱技术检测小鼠各脑区总铁含量
        2.7 酶联免疫吸附测定
        2.8 统计学处理
结果
    1.SN区过表达α-syn对小鼠铁代谢的影响
        1.1 AAV介导的EGFP与 α-syn在小鼠SN区的表达
        1.2 小鼠SN区人源α-syn含量的检测
        1.3 SN区过表达α-syn对小鼠SN区 TH阳性细胞数和TH蛋白表达的影响
        1.4 SN区过表达α-syn对小鼠运动能力的影响
        1.5 SN区过表达α-syn对小鼠焦虑程度的影响
        1.6 SN区过表达α-syn对小鼠SN区总铁水平和铁染色阳性细胞数目的影响
        1.7 SN区过表达α-syn对小鼠SN区 DMT1、FPN1和IRP1 蛋白表达的影响
        1.8 SN区过表达α-syn对小鼠Str区总铁水平的影响
        1.9 SN区过表达α-syn对小鼠Str区 α-syn、TH和 FPN1 蛋白表达的影响
    2.VTA区过表达α-syn对小鼠铁代谢的影响
        2.1 AAV介导的EGFP与 α-syn在小鼠VTA区的表达
        2.2 VTA区过表达α-syn对小鼠VTA区 TH阳性细胞数的影响
        2.3 VTA区过表达α-syn对小鼠VTA区铁阳性细胞数的影响
        2.4 VTA区过表达α-syn对小鼠VTA区 DMT1 阳性细胞数的影响
讨论
结论
参考文献
综述
    综述参考文献
攻读学位期间的研究成果
缩略词表
致谢

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本文编号：2826877