芳香化酶对hSOD1-G93A转基因模型的神经保护作用研究

发布时间：2020-09-26 19:57

　　背景:肌萎缩性侧索硬化(Amyotrophic lateral sclerosis,ALS)是一种致死性的神经变性疾病,其特征为进行性加重的肌肉萎缩和肌肉无力,该病是由于大脑皮层、脑干和脊髓前角的运动神经元的变性、丢失所致。迄今为止,ALS的确切发病机制尚未阐明,尚无有效的治疗方法。在ALS人群中,90-95%的病人为散发性,称为散发型ALS(sporadic ALS,sALS),另有5-10%有明显的家族史,称为家族型ALS(familial ALS,fALS),在fALS中约20%(总的ALS病人中约2%)与突变的Cu/Zn超氧化物歧化酶(SOD1)有关。目前认为异常蛋白错误折叠形成聚集体,具有细胞毒性,是导致fALS疾病的机制之一。以往研究发现ALS发病比率男性高于女性,尤其是绝经期前,这种差异更为明显,预示着雌激素及其合成过程中的关键酶芳香化酶在ALS疾病的发生、发展中具有重要的作用。近年来,越来越多的证据证实雌激素在多种神经变性疾病,包括ALS中具有神经保护作用。芳香化酶(aromatase)是将雄激素催化合成雌激素的关键酶,多数观点认为芳香化酶因其产物雌激素的作用具有神经保护作用。在中枢神经系统中(central nervous system,CNS),来自卵巢的循环雌激素和通过芳香化酶合成的局部雌激素可能均具有神经保护效果,包括提高运动神经元的存活,增加神经营养因子。雌激素可能通过激活雌激素受体来发挥神经保护作用。研究表明携带人SOD1-G93A(hSOD1-G93A)的转基因小鼠可出现类似ALS病人的临床及组织病理特征,因此,hSOD1-G93A转基因小鼠得到广泛应用,成为研究ALS病理机制和治疗策略的动物模型。在以往的研究中,我们实验小组已经探讨了卵巢切除对hSOD1-G93A转基因小鼠发病及行为学的影响,结果显示卵巢切除可使hSOD1-G93A转基因小鼠发病提前,但对平均寿命没有影响;与对照组相比,卵巢切除的hSOD1-G93A小鼠体重显著减轻提前4周,转轮时间减少提前1周,说明雌激素可能推迟转基因小鼠发病。目前关于雌激素对这个ALS动物模型影响的机制的研究少见。因此,在本研究中,我们应用蛋白免疫印迹技术来检测卵巢切除对hSOD1-G93A转基因小鼠脊髓腰段芳香化酶和雌激素受体的蛋白表达水平,评估由M1型小胶质细胞分泌的炎性因子肿瘤坏死因子α(TNF-α),M2型小胶质细胞分泌的抗炎因子arginase-1和转化生长因子β(TGF-β),另外也分析卵巢切除对hSOD1-G93A小鼠腰Bcl-2和Bax蛋白表达水平的影响,探讨雌激素介导的神经保护作用的机制。为了探讨芳香化酶对hSOD1-G93A转基因影响机制,我们通过细胞转染技术,上调或敲减稳转hSOD1-G93A质粒的NSC-34细胞株(hSOD1-G93A)芳香化酶基因的表达,探讨芳香化酶表达的变化对hSOD1-G93A细胞增殖、分化及细胞膜、线粒体损伤的影响;进一步应用蛋白免疫印迹的方法检测凋亡标记物cleaved-caspase-9、Bcl-2或Bax蛋白水平的变化,观察芳香化酶对hSOD1-G93A细胞影响的机制;检测芳香化酶对雌激素受体ER-α、ER-β及GPR30的影响,并应用相应的雌激素受体抑制剂ICI 182,780、G15或雌激素(雌二醇,E2)对转染后的hSOD1-G93A细胞进行干预,研究芳香化酶对hSOD1-G93A细胞的影响机制。第一部分卵巢切除对hSOD1-G93A转基因小鼠的影响机制目的:观察卵巢切除对hSOD1-G93A转基因雌性小鼠腰膨大的芳香化酶、雌激素受体及炎症指标、凋亡指标表达的影响,探讨雌激素介导的神经保护作用的机制。方法:我们应用hSOD1-G93A转基因雄性小鼠和B6/SJL F1雌性小鼠交配产生的雌性子代作为实验对象,子代小鼠约30天龄时剪取鼠尾尖进行基因鉴定,明确子代小鼠是否携带hSOD1-G93A基因。9只5周龄的hSOD1-G93A小鼠随机分成3个实验组:卵巢切除组(OVX),假手术组(Sham),阳性对照组(NO-OVX)。阴性对照组(CON,n=3)是与实验组小鼠年龄相同的非转基因小鼠。OVX组小鼠在5周龄时行卵巢切除术,Sham组小鼠卵巢保持完好。上述小鼠用于蛋白免疫印迹实验。OVX组小鼠发病时其他组的小鼠同时新鲜取材,通过蛋白免疫印迹分析研究aromatase、ER-α、ER-β、GPR30、arginase-1、TGF-β1、TNF-α、IKKβ、IKBα、Bcl-2及Bax的表达特点。结果:1卵巢切除减少了hSOD1-G93A转基因小鼠腰膨大芳香化酶表达。2卵巢切除降低hSOD1-G93A转基因小鼠腰膨大ER-α的表达,但对ER-β的表达未见明显影响,然而卵巢切除和假手术均降低GPR30的表达。3卵巢切除降低hSOD1-G93A转基因小鼠腰膨大抗炎因子arginase-1的表达水平;卵巢切除与假手术均降低TGF-β表达水平,提高TNF-α及IKKβ的表达水平;卵巢切除对IKBα的表达水平没有影响。4卵巢切除下调hSOD1-G93A转基因小鼠腰膨大抗凋亡蛋白Bcl-2的水平,但是卵巢切除与假手术均提高促凋亡蛋白Bax的表达。第二部分Cyp19a1过表达对稳转hSOD1-G93A的NSC-34细胞的保护作用目的:本研究的目的是在稳转hSOD1-G93A的NSC-34细胞中瞬转Cyp19a1 cDNA质粒探讨芳香化酶表达增多对ALS的保护作用及其机制。方法:准备转染质粒时首先将稳转hSOD1-G93A的NSC-34细胞(hSOD1-G93A)用含有0.25%EDTA-胰酶消化后均匀接种至六孔板。待细胞完全贴壁后将培养基换为无酚红无血清的培养基,观察细胞达到约60-70%的汇合度时,进行Cyp19a1 cDNA质粒及对照空质粒的转染。实验需要ICI-182,780或G15进行干预时,在转染前半小时加入无酚红无血清的培养基。在质粒转染48小时后,收集细胞使用RT-PCR法检测转染对照空质粒组(CYP-E)及转染Cyp19a1 cDNA质粒组(Cyp19a1-Overexpression,CYP-OE)的Cyp19a1 m RNA的相对水平,并采用蛋白免疫印迹法测定hSOD1-G93A未转染质粒组(hSOD1-G93A)、CYP-E组及CYP-OE组芳香化酶的相对水平;收集细胞应用透射电子显微镜观察细胞中线粒体的改变,观察细胞状况;采用CCK-8的方法分别检测各组细胞的活力;采用LDH法分别检测各组的LDH活性,观察各组细胞膜受损情况;应用蛋白免疫印迹法对凋亡指标cleaved-caspase-9、Bax、Bcl2及雌激素受体ER-α、ER-β和GPR30的表达进行定量测定。使用ICI 182,780或G15阻断相应雌激素受体后再对上述凋亡指标的表达情况进行测定,了解芳香化酶通过影响哪一种雌激素受体对hSOD1-G93A细胞起保护作用。结果:1 Cyp19a1 cDNA质粒转染48小时后,CYP-OE组的Cyp19a1的mRNA及芳香化酶蛋白的相对水平明显增高。2与对照组相比,CYP-OE组细胞的线粒体结构相对完整,空泡变不明显;细胞活力明显增加,LDH活性降低。3与对照组相比,CYP-OE组细胞的cleaved-caspase-9和Bax表达水平下降、Bcl2的表达水平升高。4芳香化酶表达增多可增加ER-α和GPR30表达,ICI 182,780可阻止芳香化酶的抗凋亡作用,G15不能。第三部分Cyp19a1敲减对稳转hSOD1-G93A的NSC-34细胞的影响目的:本研究目的是通过在稳转hSOD1-G93A的NSC-34细胞中瞬转Cyp19a1 ShRNA质粒探讨芳香化酶表达减少对ALS的作用及其机制。方法:使用稳转hSOD1-G93A的NSC-34细胞(hSOD1-G93A),在准备转染质粒时首先将hSOD1-G93A细胞用含有0.25%EDTA-胰酶消化后均匀接种至六孔板。待细胞完全贴壁后将培养基换为无酚红无血清的培养基,观察当细胞达到约60-70%的汇合度时,进行Cyp19a1 ShRNA质粒及对照含RFP荧光的空质粒的转染。在质粒转染48小时后,使用RT-PCR法检测转染对照含RFP荧光的空质粒组(E)及转染Cyp19a1ShRNA质粒组(ShRNA)Cyp19a1 mRNA的相对水平,并采用蛋白免疫印迹法检测未转染质粒的hSOD1-G93A组(h SOD1-G93A)、E组及ShRNA组的芳香化酶蛋白的表达水平;采用CCK-8的方法分别检测hSOD1-G93A组、E组及ShRNA组的细胞活力;采用LDH法分别检测各组的LDH活性;收集细胞应用透射电子显微镜观察细胞中线粒体、内质网的改变,观察细胞状况;采用蛋白免疫印迹方法对各组凋亡指标cleaved-caspase-9和Bcl2的表达及雌激素受体ER-α进行测定。接着我们在转染Cyp19a1 ShRNA质粒的细胞培养基中同时加入Estradiol(E2),观察芳香化酶表达量减少对凋亡的影响能否被E2逆转。结果:1 ShRNA质粒转染可以减少Cyp19a1的mRNA及芳香化酶蛋白的表达水平。2与对照组相比,ShRNA组细胞损伤加剧,表现为线粒体肿胀明显,线粒体嵴断裂及消失明显,空泡化明显,细胞增殖活力下降,LDH活性增高。3与对照组相比,ShRNA组细胞cleaved caspase-9表达水平增加、Bcl2的表达水平下降,促进hSOD1-G93A NSC-34细胞凋亡;ShRNA组ER-α表达水平下降。4与对照组相比,ShRNA+E2组cleaved caspase-9表达水平下降、Bcl2的表达水平升高。结论:1卵巢切除降低hSOD1-G93A转基因小鼠腰膨大芳香化酶、ER-α的表达,通过下调arginase-1及Bcl-2促进炎症和凋亡的发生。2芳香化酶表达增多可增强hSOD1-G93A细胞的增殖能力,减少细胞损伤,激活ER-α的表达,通过抗凋亡机制,对h SOD1-G93A NSC-34细胞起到神经保护作用。3芳香化酶表达减少可降低hSOD1-G93A细胞的增殖能力,增加细胞损伤,促进细胞凋亡,调低ER-α表达水平;E2可逆转芳香化酶减少引起的促凋亡作用。
【学位单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R744.8
【部分图文】：

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图1卵巢切除对hSOD1-G93A转基因小鼠腰膨大芳香化酶及ER-α、ER-β及 GPR30 蛋白表达的影响Fig. 1 The effects of ovariectomy on the expression of ER-α、ER-βandGPR30 in the lumbar bulbar of hSOD1-G93A transgencic mice.Note: Western blotting showed that ovariectomy reduced the protein levelsof aromatase (A, B) and ER-α(C, D) but not ER-β expression (D, E), whileboth ovariectomy and the sham operation decreased GPR30 expression (D, F)in the lumbar spinal cord in hSOD1-G93A transgenic mice. *P<0.05 vs.CON.△P<0.05 vs. NO-OVX.#P<0.05 vs. Sham.

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图 2 卵巢切除对 hSOD1-G93A 转基因小鼠腰膨大 arginase-1、TGF-β 及TNF-α 蛋白表达的影响Fig. 2 The effects of ovariectomy on the expression of arginase-1、TGF-βandTNF-αin the lumbar bulbar of hSOD1-G93A transgencic mice.Note: Western blotting showed that ovariectomy decreased the expression ofarginase-1 (A, B), and both ovariectomy and the sham operation reduced theexpression of TGF-β (A, C) and increased the expression of TNF-α (A, D).*P<0.05 vs. CON.△P<0.05 vs. NO-OVX.#P<0.05 vs. Sham.

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图 3 卵巢切除对 hSOD1-G93A 转基因小鼠腰膨大 IKKβ 及 IKBα 蛋白表达的影响Fig. 3 The effects of ovariectomy on the expression of IKKβand IKBα in thelumbar bulbar of hSOD1-G93A transgencic mice.Note: Western blotting showed that ovariectomy increased the expression ofIKKβ (A, B) but had no effects on that of IKBα (C, D). *P<0.05 vs. CON.△P<0.05 vs. NO-OVX.

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