基于微阵列芯片筛选糖尿病周围神经病变差异表达基因及其功能分析

发布时间：2020-10-01 19:51

　　 研究背景:周围神经病变是常见的糖尿病并发症,其确切的发病机制仍不清楚。lncRNA和miRNA广泛参与了各种生物学过程,对疾病的发生发展起了关键的作用,然而在糖尿病周围神经病变中却尚未被系统研究。本研究分为两部分,结合mRNA,分别研究miRNA和lncRNA在糖尿病周围神经病变中的作用。第一部分糖尿病周围神经病变miRNA-mRNA调节机制分析目的:全面揭示糖尿病周围神经病变大鼠背根神经节中差异表达的miRNA及其靶基因mRNA在神经病变中的调节作用。方法:使用20只8周龄、体重在180-220g的健康雄性SD大鼠,随机分成两组(糖尿病组和对照组)。禁食不禁水12小时后,糖尿病组腹腔注射链脲佐菌素(65mg/kg),对照组腹腔注射等体积的柠檬酸盐缓冲液。7天后取尾静脉血检测非空腹血糖,血糖大于16.7mM表示糖尿病诱导成功。继续饲养8周后评估周围神经是否发生病变,我们采用电子测痛仪(Electronic Von Frey)测量缩足反应阈值以及坐骨神经横截面透射电镜两种方法进行评估。随后对大鼠处以安乐死,收集双侧L3-L6背根神经节,提取总RNA。采用微阵列芯片筛选出差异表达的miRNA和mRNA(Affymetrix GeneChip miRNA 4.0 Array和Affymetrix GeneChip Rat Transcriptome Array 1.0)。利用miRanda数据库,对miRNA靶基因进行预测,然后与筛选出的差异mRNA取交集,并进一步筛选出与相应miRNA呈负相关的mRNA。对所得出的mRNA进行GO和pathway分析,鉴别出富集的基因功能和信号通路,同时结合差异miRNA构建miRNA-mRNA调控网络,进一步鉴别出网络中的关键调控基因。最后,我们对关键的miRNA进行PCR验证。结果:非空腹血糖检测提示1只实验组大鼠血糖不符合标准,因此排除。与对照组相比,糖尿病组的缩足反应阈值显著降低,透射电镜提示坐骨神经明显的髓鞘分离和脱髓鞘。通过微阵列芯片检测,我们发现了37个miRNA和1357个mRNA在糖尿病周围神经病变大鼠背根神经节中差异表达。对筛选出的mRNA做GO和pathway分析,共得出399个显著富集的GO terms(257个为下调、142个为上调)和29个显著富集的pathway(23个为下调、6个为上调)。对miRNA-mRNA调控网络进行分析,我们得出rno-miR-330-5p,rno-miR-17-1-3p和rno-miR-346可能是网络的核心,而mRNA中Podxl和Hoxa1拥有最高的连接度。PCR的验证结果与基因芯片结果相一致。结论:本研究成功诱导了糖尿病周围神经病变大鼠,并筛选出了糖尿病周围神经病变大鼠背根神经节中异常表达的miRNA和mRNA。通过GO分析、pathway分析和miRNA-mRNA调控网络分析,我们发现这些差异表达基因可能对糖尿病周围神经病变起了重要的作用。第二部分糖尿病周围神经病变lncRNA-mRNA表达谱分析及ceRNA网络构建目的:综合分析lncRNA和mRNA的生物信息学功能,以及在糖尿病周围神经病变中的作用,同时构建lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA网络。方法:糖尿病造模、组织取材同第一部分。采用微阵列芯片Affymetrix GeneChip Rat Transcriptome Array 1.0筛选异常表达的lncRNA和mRNA。对差异表达的mRNA进行GO和pathway分析,鉴别出富集的基因功能和信号通路。将GO和pathway分析结果的交叉基因进行signal-net分析,鉴别出可能的关键基因。建立lncRNA-mRNA共表达网络,确定lncRNA与mRNA的相互作用模型,进而分析lncRNA在糖尿病周围神经病变中可能的调节作用。根据竞争性内源性RNA(ceRNA)假说,结合所获得的差异miRNA、lncRNA和mRNA数据,我们进一步建立ceR NA网络,探讨ceR NA网络在糖尿病周围神经病变中的作用。最后,我们对其中的关键基因进行了PCR和Western blot验证。结果:我们共发现了983个lncRNA和1357个mRNA异常表达。对这1357的差异表达mRNA做GO和pathway分析,共得出558个显著富集的GO term(s368个为下调、190个为上调)和94个显著富集的pathway(57个为下调、37个为上调)。signal-net分析提示Plcd和Itgb3拥有最高的中介中心性(betweenness centrality),而整合素受体(Itgb3、Itgb1、Itgb8和Itga6)拥有最高的连接度,提示这些mRNA的重要性。我们建立的lncRNA-mRNA共表达网络中,共包含474个lncRNA和169个mRNA。网络中包含1426个lncRNA-mRNA连接,其中569个为负相关,857个为正相关,lncRNA speegaw.aSep08-unspliced具有最高的连接度,而mRNA中Scd1、Map4k4和Tyrp1具有最高的连接度。ceR NA网络分析提示,差异基因与鞘脂类代谢等生物过程,以及IL-17信号通路、PPAR信号通路以及Wnt信号通路相关。PCR和Western blot验证结果提示基因芯片结果具有高度的可靠性。结论:本研究提示差异表达的lncRNA通过调节共表达的mRNA,对糖尿病周围神经病变的病理过程起了重要调节作用。与此同时,ceR NA网络也参与糖尿病周围神经病变多种病理生理过程,提示其在疾病中的重要性。
【学位单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R587.2;R747.9
【部分图文】：

图 1-1. 糖尿病大鼠诱导及样本采集流程。3. 行为学测试机械性痛觉超敏（mechanical allodynia）常用于检测糖尿病周围神经病变的一种

如下图所示（图 1-2），我们采用多步分析方法，筛选出糖尿病周围神经神经节中差异表达 miRNA 和 mRNA 并进行分析，通过对基因功能和相行分析，同时建立 miRNA 和 mRNA 的相互调节网络，进一步筛选出可。

0.001）（图 1-3-C）。此外，实验组大鼠也表现出明显的多尿（158 ± 9 ml/24h vs. 21 ±2 ml/24h，p＜0.001）（图 1-3-F）、多饮（191 ± 10 ml/24h vs. 51 ± 4 ml/24h，p＜0.001）（图 1-3-E）以及多食（56.4 ± 2.3 g/24h vs. 22.3 ± 1.6 g/24h，p＜0.001）（图 1-3-D）。

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本文编号：2831930