miR-330-5p靶向ITGA5抑制胶质母细胞瘤的恶性表型及其机制研究

发布时间：2020-10-02 06:28

　　 背景和目的:脑胶质瘤是颅内常见的恶性肿瘤,起源于中枢神经系统,约占中枢神经系统肿瘤的45%。形态上,胶质瘤呈浸润生长,侵袭性生长,界限不清,因此手术很难完全切除,术后易复发。尽管以手术为主联合放射治疗及化学治疗的综合方案已成为治疗指南,但是对于高级别胶质瘤(WHO分级Ⅲ级,Ⅳ级)患者,在影像导引、神经电生理监测等新技术的辅助下进行“最大范围的安全切除”后,结果也并不十分理想,预后改善不显著。MicroRNAs(即miRNAs,微小RNAs)是一种小的非编码RNA。近年来,国内外对miRNA进行了大量研究。目前已知其在多种肿瘤的发生、发展中均发挥了重要的作用,并且近年来被认为是抗肿瘤治疗的新靶点。大多数的miRNAs通过直接靶向作用于癌基因或抑癌基因,从而参与了人类各种肿瘤发生及其恶性表型。在本研究中,我们研究了一种在胶质瘤中研究较少的MicroRNA,即Micro-330-5p。该MicroRNA的靶向基因是ITGA5。然而,ITGA5在不同肿瘤中的作用不同,其在胶质瘤中的功能也尚未清楚。本文旨在研究miRNA-330-5p及其靶基因ITGA5在胶质瘤中的功能和作用。该项研究为miRNA-330-5p可以作为胶质瘤诊断和治疗的靶点提供了理论依据,为肿瘤进展过程中的分子调控机制研究提供了一个全新方向。方法:通过RT-qPCR技术检测miR-330-5p和ITGA5 mRNA在GBM细胞系(U87、U251和U373)和正常脑胶质细胞(HEB)中的表达。Western blot技术检测ITGA5以及相关恶性表型蛋白的表达。采用MTT法、集落形成法、Transwell法、划痕实验法、流式细胞术测定GBM细胞的生物学功能(包括细胞增殖、侵袭、迁移、凋亡、细胞周期等方面)。通过双荧光素酶报告基因检测,确定miR-330-5p与ITGA5的靶向关系。裸鼠成瘤实验检测miR-330-5p是否在动物体内发挥同样的功能。结果:RT-qPCR检测miR-330-5p在GBM细胞系(U87、U251和U373)和人GBM脑组织中低表达,在正常脑胶质细胞(HEB)和非肿瘤脑组织中高表达。Western blot检测ITGA5蛋白在胶质瘤中高表达,并且上调miR-330-5p可以降低Ki67,N-Cadherin和MMP2的表达,促进caspase-3的激活。通过双荧光素酶报告基因检测,确定了miR-330-5p可以靶向抑制ITGA5的表达。MTT法、菌落形成法、Transwell法、创面愈合法、流式细胞术测定GBM细胞的生物学功能显示,miR-330-5p上调和ITGA5下调对细胞增殖、侵袭和迁移均有抑制作用。同时,它们还能促进GBM细胞凋亡。裸鼠皮下呈瘤结果显示,与NC组比较,miR-330-5p上调的细胞系成瘤速度较慢。在体内所表达的侵袭、增殖的相关蛋白表达较低,而凋亡率较高。结论:miRNA-330-5p可以靶向抑制癌基因ITGA5的表达,从而抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力,促进肿瘤细胞的凋亡。因此,对miR-330-5p抑制胶质瘤细胞恶性表型的作用机制进行深入研究,将为胶质瘤的临床诊疗提供新的方向,具有重要的临床意义。
【学位单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R739.4
【部分图文】：

图 1. MicroRNA-330-5p 在 GBM 及细胞系中低表达(A) qRT-PCR 结果显示 miR-330-5p 在非肿瘤脑组织（NBT，n=5）与 GBM 组织（n=8）的表达差异，在 GBM 中低表达。（B）qRT-PCR 结果显示 miR-330-5p 在人正常胶质细胞 HEB，高级别胶质瘤细胞系 U87,U251,U373 中的表达差异。在胶质瘤细胞系中低表达，其中 U251 中表达最低。(C)组织 Fish 结果显示 miR-330-5p在非肿瘤脑组织与 GBM 组织的表达差异。（D）Fish 结果的统计结果。所有的实验都是重复 3 遍。* P < 0.05;** P <0.01，*** P < 0.001。

图 2. （A）ITGA5 在 TCGA 数据库中分析的结果中提示，在 NBT 和 GBM 中存在表达差异。（B）免疫组化提示 ITGA5 在 GBM 中高表达。（C）Western Blot 结果显示 ITGA5 在胶质细胞系 U87、U251 和 U373 中高表达，尤其是在 U251 中表达最高。（D）Western Blot结果统计。所有的实验都是重复 3 遍。* P < 0.05;** P < 0.01，*** P < 0.001。

南京医科大学博士学位论文3. ITGA5 是 miR-330-5p 的下游靶点为了验证我们的预测，我们进行了双荧光素酶报告基因检测。如图所示，我们发现随着 miR-330-5p mimic 的存在，ITGA5-wt 组的荧光素酶活性较 NC 组明显降低(P<0.05)，说明 miR-330-5p 可以直接靶向 ITGA5（图 3A，B）。另外，我们利用 Western blot 检测 miR-330-5p 对 ITGA5 表达水平的影响。我们可以很容易地观察到，在转染 miR-330-5p 或 siRNA-ITGA5 的细胞中，与单独转染 NC 或对照组相比，ITGA5 的 mRNA 和蛋白水平均显著下降。过表达 ITGA5 可恢复miR-330-5p mimics 的作用(P<0.05，图 3C 和 D)，提示 miR-330-5p 可抑制 GBM细胞中 ITGA5 的表达。

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本文编号：2832044