不同浓度Necrostatin-1对小鼠癫痫持续状态后海马神经细胞的保护作用

发布时间：2020-10-09 05:00

　　目的:探讨不同浓度程序性坏死特异性抑制剂Necrostatin-1(Nec-1)对海人酸(kainic acid,KA)诱导小鼠癫痫持续状态(status epilepticus,SE)后海马区神经细胞的作用,并探讨Nec-1对神经细胞保护作用最佳的浓度。方法:将252只体重25-30g雄性ICR小鼠随机分为DMSO组、DMSO+KANICE ACID组、不同剂量Nec-1干预(10μmol·L-1、20μmol·L-1、40μmol·L-1、80μmol·L-1)组,共6个组。采用腹腔注射海人酸12mg/kg建立小鼠癫痫持续状态模型,于腹腔注射前15min经左侧脑室给予不同浓度干预剂Nec-1。在模型成功后不同时间点(24h、48h、72h)通过Western blot方法检测海马组织中程序性坏死相关蛋白RIP1、MLKL以及凋亡相关蛋白Cleaved-caspase3、Bax的表达情况,筛选癫痫发生后上述蛋白表达最明显时间点。免疫组化和Western blot方法检测海马组织中程序性坏死相关蛋白RIP1、RIP3、MLKL以及凋亡相关蛋白B-cell lymphoma 2(Bcl-2)、Cleaved-caspase3、Bax的表达情况。采用免疫组化H-E染色观察小鼠海马神经元细胞的的病理形态学改变;Tunnel染色检测小鼠海马神经元细胞凋亡的影响,从而筛选出Nec-1保护神经细胞的最佳浓度。结果:(1)癫痫发作后24小时,Western blot显示:DMSO+KANICE ACID组MLKL、RIP1、Bax、Cleave-caspase3表达最明显,DMSO组与DMSO+KANIC ACID组比值最高。(2)癫痫发作后24小时,Western blot结果显示:40μmol·L-1治疗组可明显下调RIP1、MLKL、RIP3、Cleaved-caspase3、Bax蛋白的表达,上调Bcl-2表达。(3)小鼠癫痫发作后24h IHC结果显示:DMSO组RIP1、MLKL、RIP3、Cleaved-caspase3、Bax蛋白的表达量均较少,癫痫发作后海马组织中RIP1、MLKL、RIP3、Cleaved-caspase3、Bax蛋白量显著增加(P0.05)。给予Nec-1干预之后,随着浓度增加细胞阳性率呈下降趋势,80μmol·L-1治疗组较40μmol·L-1治疗组出现轻微上升趋势,40μmol·L-1Nec-1治疗组可显著下调RIP1、MLKL、RIP3、cleaved-caspase3、Bax蛋白的表达(P0.05)。(4)HE染色可见DMSO组海马CA3区细胞排列整齐,形态正常;DMSO+KANIC ACID组细胞排列散乱,部分胞浆有空泡形成,有的神经元肿胀、分布不均、核固缩、核仁消失;40μmol·L-1Nec-1治疗组能明显减轻神经元胞体肿胀、核固缩等细胞形态学变化。(5)TUNEL染色可见DMSO组海马CA3区可见少量棕褐色的TUNEL阳性颗粒细胞,而DMSO+KANICE ACID组海马CA3区可见大量棕褐色阳性细胞。与DMSO+KANICE ACID组相比,40μmol·L-1Nec-1组CA3区TUNEL阳性细胞明显减少(P0.05)。结论:1.与DMSO+KANICE ACID组相比,40μmol·L-1 Nec-1治疗组下调RIP1、MLKL、RIP3、Cleaved-caspase3、Bax蛋白表达最明显。2.40μmol·L-1Nec-1治疗组对KA诱导的小鼠SE后海马神经元的保护作用较其他浓度治疗组更为明显。
【学位单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R742.1
【部分图文】：

癫痫持续状态,阵挛,小鼠,前肢

图 1 小鼠癫痫持续状态（A—Ⅳ级双侧前肢抽搐伴站立 B—Ⅴ级全身强直-阵挛抽搐伴跌倒）。2.海人酸诱导小鼠 SE 后(24h、48h、72h)海马组织 RIP1 、MLKLCleaved-Caspase3、Bax 蛋白的影响癫痫发作后 24，48，72h，采用 Western blot 法检测小鼠海马组织凋亡及程序性坏死相关蛋白，结果表明，DMSO+KANICACID 组与 DMSO 组 MLKL、RIP1Bax、Cleaved-caspase3 蛋白表达比值最高。我推测海人酸诱导小鼠癫痫模型作用24h 对小鼠海马组织的损伤最明显，因此本课题选定 24h 为实验作用时间。

小鼠,海人酸,癫痫持续状态,阵挛

A B图 1 小鼠癫痫持续状态（A—Ⅳ级双侧前肢抽搐伴站立 B—Ⅴ级全身强直-阵挛抽搐伴跌倒）。2.海人酸诱导小鼠 SE 后(24h、48h、72h)海马组织 RIP1 、MLKL、Cleaved-Caspase3、Bax 蛋白的影响癫痫发作后 24，48，72h，采用 Western blot 法检测小鼠海马组织凋亡及程序性坏死相关蛋白，结果表明，DMSO+KANICACID 组与 DMSO 组 MLKL、RIP1、Bax、Cleaved-caspase3 蛋白表达比值最高。我推测海人酸诱导小鼠癫痫模型作用24h 对小鼠海马组织的损伤最明显，因此本课题选定 24h 为实验作用时间。

锥体细胞,海马CA3区,小鼠,胞核

3. HE 染色检测不同剂量 Nec-1 对海人酸诱导小鼠 SE 后海马神经元的影响HE 染色观察 CA3 区细胞形态学变化，结果显示；DMSO 组海马组织形态及结构正常，细胞排列规整，着色均匀，胞核及核仁大小正常，胞浆及胞核染色清亮，呈浅红色和淡蓝色。DMSO+KANICE ACID 组细胞形态与结构明显紊乱，锥体细胞明显丢失，胞浆透明，胞核及胞浆染色呈深蓝色和紫蓝色，且着色不均匀，大小不一，形态各异，有些神经元发生肿胀呈透明空泡化，有些神经元体积缩小，细胞核固缩深染、核仁变小甚至消失，尤以 CA3 区更为显著。随着 Nec-1 治疗组浓度的加深虽可见细胞排列紊乱减轻，胞核深染与皱缩减少，其中 40umolNec-1治疗组细胞排列规整，较 DMSO+KANICE ACID 组有明显改善，(详见图 3 A～F)。

【参考文献】