外泌体介导的miR-1238调控胶质瘤替莫唑胺耐药机理研究

发布时间：2020-10-09 19:22

　　 背景与目的:胶质瘤是成人中枢神经系统最常见的原发肿瘤。胶质母细胞瘤是胶质瘤最常见也是最致命的亚型。因其异质性强、生长速度快等特点,患者中位生存期较低。外科方法切除肿瘤辅以术后标准化放疗和化疗是目前治疗恶性脑胶质瘤的公认治疗方案。替莫唑胺是二代口服烷化剂,由于其对恶性胶质瘤杀伤性强等特点,被用作治疗胶质瘤的标准化疗药物。但替莫唑胺耐药已成为临床棘手和亟待解决的问题,且化疗耐药机理仍有待深入了解。外泌体是目前定义及功能最为明确的胞外囊泡,因其在细胞间通讯过程中的信使作用而备受关注。外泌体可包裹RNA和蛋白等至受体细胞,对受体细胞生物学功能发挥一定调控作用。其中研究最多的目标是外泌体中miRNA和lncRNA。在本研究中,我们以miR-1238为研究目标,拟探究外泌体miR-1238调控恶性胶质瘤替莫唑胺耐药相关机制。材料与方法:1.分步诱导法构建替莫唑胺耐药细胞系。CCK-8、细胞平板克隆验证耐药细胞耐药程度。2.应用qRT-PCR检测miR-1238在肿瘤细胞、肿瘤标本及血清标本中差异表达情况。3.超速离心法提取细胞外泌体。扫描电镜、纳米示踪技术和western blot鉴定外泌体。4.外泌体孵育模型处理敏感细胞。CCK-8、细胞平板克隆、流式细胞法检测受体细胞替莫唑胺耐药表型改变5.应用软件预测、生物信息学分析、western blot和双荧光素酶报告基因分析miR-1238潜在靶基因。6.回复实验验证miR-1238/CAV1信号通路调控胶质瘤替莫唑胺耐药。7.裸鼠体内验证外泌体miR-1238调控胶质瘤细胞替莫唑胺耐药作用。研究结果:1.成功构建出两株耐药细胞系:U251r和N3r。耐药指数约为相应敏感细胞的6-8倍。miR-1238在复发GBM样本和TMZ耐药细胞系中高表达。2.胞外miR-1238表达水平越高,细胞TMZ耐药性越强。复发GBM患者血清中miR-1238表达水平较原发GBM患者高。3.耐药细胞源性外泌体可包裹miR-1238至敏感细胞。4.耐药细胞外泌体可显著增强敏感细胞耐药性,且miR-1238起关键作用。5.CAV1是miR-1238潜在靶基因。6.miR-1238/CAV1信号通路调控GBM细胞耐药性。7.耐药细胞源性外泌体介导miR-1238体内增强GBM对TMZ耐药性。研究结论:1.血清miR-1238水平可预测胶质瘤患者替莫唑胺化疗敏感性。2.耐药细胞源性外泌体包裹miR-1238至敏感细胞可增强受体细胞耐药性。3.miR-1238通过靶向CAV1调控胶质瘤细胞替莫唑胺耐药。
【学位单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R739.4
【部分图文】：

养上清中 miR-1238 表达水平显著高于敏感细胞培养上清（Condition medium, CM）（图 2C）；超速离心法收集两种细胞培养上清中外泌体（Exosomes），qRT-PCR检测发现耐药细胞外泌体中miR-1238表达水平显著高于敏感细胞外泌体（图2D）。以上实验结果提示，GBM 细胞外泌体中 miR-1238 水平越高，其耐药性越强；GBM 患者外周动脉血中 miR-1238 水平可作为评估患者化疗敏感性的指标。

图 4：耐药细胞源性外泌体包裹 miR-1238 至敏感细胞增强其耐药性（A）：qRT-PCR 验证 miR-1238 在 U251r 和 N3r 细胞中敲低效率。（B）：qRT-PCR确认 miR-1238 低表达外泌体（1238-down Exo）中 miR-1238 表达水平。（C 和 D）：CCK-8 实验验证不同类型外泌体对敏感细胞耐药性调控作用。（E）：平板克隆实验验证不同类型外泌体对敏感细胞耐药性调控作用。（F）：流式细胞法验证不同类型外泌体对敏感细胞受 TMZ 处理后凋亡水平调控作用。（G）：Western blot 检测不同类型外泌体孵育敏感细胞后，细胞内 cleaved caspase-3 表达水平改变。*p < 0.05, **p< 0.01。5. CAV1 是 miR-1238 的直接靶点为探究外泌体 miR-1238 促进受体细胞耐药的潜在机制，我们通过TargetScan，miWalk 和 RNA22 预测网站发现 CAV1 是 miR-1238 的潜在靶点（图5A）。 CAV1 是 Caveolin 家族中研究最多的成员，既可作为肿瘤抑制因子，也可

敲低外泌体中 miR-1238 后，凋亡率则显著升高（图7D）。肿瘤形成后 27 天，我们收集了小鼠外周动脉血，并检测分析了小鼠血清中 miR-1238 表达水平。结果提示肿瘤体积越大，小鼠动脉血血清中 miR-1238表达水平也越高，小鼠对 TMZ 耐受性更强（图 8E）。以上结果证实耐药细胞源性外泌体可传递 miR-1238 至敏感细胞促进受体细胞耐药；同时也证实了我们先前的结论，即血清外泌体内 miR-1238 水平可预测肿瘤化疗敏感性。

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 王帅;赵晓丽;朱晗;;替莫唑胺治疗复发性原发中枢神经系统淋巴瘤的临床效果[J];南京医科大学学报(自然科学版);2019年04期

2 郭珊珊;朱仲玲;徐辉;丁凤霞;王国成;赵敏;阎昭;;替莫唑胺酯对脑胶质瘤的作用及其机制研究[J];中国临床药理学杂志;2015年13期

3 王毓;谢莉;胡世颉;李兵;韩林章;;脑胶质瘤术后口服替莫唑胺的护理体会[J];现代生物医学进展;2014年23期

4 钟诚;王彬;吕胜青;;替莫唑胺在肿瘤化疗中的应用进展[J];中国现代神经疾病杂志;2013年12期

5 李宏业;徐军;周士振;王秀华;赵玉娥;朱玉方;陶荣杰;;替莫唑胺配合放疗治疗原发性中枢神经系统淋巴瘤的临床观察[J];中华肿瘤防治杂志;2010年12期

6 孙国涛;孙祥民;陶荣杰;;替莫唑胺治疗原发性中枢神经系统淋巴瘤5例分析[J];慢性病学杂志;2010年11期

7 韦敏;肖亿;;替莫唑胺的临床应用进展[J];现代医药卫生;2006年12期

8 蔡霞 ,冯光玲 ,任业明;替莫唑胺的合成[J];山东医药工业;2003年04期

9 杜小莉;治疗顽固性多形性成胶质细胞瘤的新药——替莫唑胺[J];中国药学杂志;2000年02期

10 陈泽慧;张跃强;;原发中枢神经系统淋巴瘤患者接受放疗与替莫唑胺为主的化疗治疗效果[J];医学理论与实践;2019年03期

相关会议论文 前10条

1 鞠海涛;李红;王宏伟;窦长武;;恶性胶质瘤化疗中替莫唑胺的不良反应分析[A];中国中西医结合学会神经外科专业委员会第二届学术大会论文集[C];2015年

2 徐军;周士振;朱玉方;陶荣杰;;替莫唑胺配合放疗治疗原发性中枢神经系统淋巴瘤的临床研究[A];中华医学会神经外科学分会第九次学术会议论文汇编[C];2010年

3 田新华;林晓宁;林锦超;魏峰;庄再旺;任磊;陈锷;孙瑾;;替莫唑胺聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒的制备方法比较[A];中华医学会神经外科学分会第九次学术会议论文汇编[C];2010年

4 姚庞妹;;10例胶质瘤患者超早期口服替莫唑胺化疗的护理[A];2014浙江省神经外科学学术年会论文汇编[C];2014年

5 刘瑜洁;齐宪荣;;基于临床的环巴胺胶束与替莫唑胺联用的抗脑胶质瘤研究[A];2015年中国药学大会暨第十五届中国药师周论文集[C];2015年

6 孙涛;董莹;张矛;;替莫唑胺联合放射治疗在非小细胞肺癌脑转移患者治疗中的作用研究[A];第13届全国肺癌学术大会论文汇编[C];2013年

7 许建萍;张湘茹;李峻岭;王宏羽;王燕;郝学志;石远凯;;替莫唑胺联合伊立替康治疗复发性非小细胞肺癌脑转移的疗效和毒副作用分析[A];中国肿瘤内科进展 中国肿瘤医师教育（2014）[C];2014年

8 陈莹;李德馨;乔艳丽;肖梅;张悦;王国成;王永峰;;反相离子对色谱二极管阵列检测器测定替莫唑胺酯原料的有关物质[A];2009年中国药学大会暨第九届中国药师周论文集[C];2009年

9 陈莹;李德馨;乔艳丽;肖梅;张悦;王国成;王永峰;;反相离子对色谱二极管阵列检测器测定替莫唑胺酯原料的有关物质[A];2010年中国药学大会暨第十届中国药师周论文集[C];2010年

10 田新华;林晓宁;林锦超;魏峰;庄再旺;任磊;陈锷;孙瑾;;脑靶向载替莫唑胺聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒体内外实验研究[A];中华医学会神经外科学分会第九次学术会议论文汇编[C];2010年

相关重要报纸文章 前8条

1 徐道;抗脑瘤老药替莫唑胺焕发生机[N];医药经济报;2010年

2 国讯;英国提示替莫唑胺的肝脏损害风险[N];中国医药报;2014年

3 董江萍;FDA增加替莫唑胺的骨髓抑制警告[N];中国医药报;2008年

4 ;替莫唑胺新适应症获批[N];医药经济报;2005年

5 刘民;替莫唑胺可长期治疗神经胶质瘤[N];中国医药报;2004年

6 雷诺岛;彻底击毙毁灭性疾病[N];医药经济报;2011年

7 郑智敏;追逐新星[N];医药经济报;2004年

8 中华核医学专业网;美国发布——肿瘤临床研究重大进展[N];健康报;2006年

相关博士学位论文 前10条

1 樊天禹;胶质母细胞瘤中抑制EZH2的表达改善替莫唑胺化疗敏感性的研究[D];南方医科大学;2016年

2 王强;木犀草素的抗胶质母细胞瘤作用及其机制研究[D];南京大学;2016年

3 杨帅;逆转胶质瘤贝伐单抗和替莫唑胺治疗耐药的方法及机制研究[D];第三军医大学;2017年

4 邸辉;miR-874的过表达促进多形性胶质母细胞瘤对替莫唑胺化疗敏感性的研究[D];天津医科大学;2017年

5 王君玉;CCND1异常表达对脑胶质瘤生物学特性及替莫唑胺敏感性影响的实验研究[D];第二军医大学;2011年

6 林靖;泛素连接酶Fbw7在人脑胶质瘤增殖、侵袭、迁移以及对替莫唑胺敏感性中的作用研究[D];第二军医大学;2016年

7 林洪;白藜芦醇诱导恶性胶质瘤细胞凋亡并增强替莫唑胺药物敏感性作用的分子机制[D];第四军医大学;2011年

8 余志云;替莫唑胺联合二甲双胍对胶质瘤及其干细胞性能的影响及机制的研究[D];吉林大学;2016年

9 高幸;蟾毒它灵对恶性胶质瘤的作用及机制的研究[D];复旦大学;2013年

10 张金锋;ATM基因沉默诱导胶质瘤细胞耐替莫唑胺的分子通路及临床转化研究[D];福建医科大学;2016年

相关硕士学位论文 前10条

1 尹建星;外泌体介导的miR-1238调控胶质瘤替莫唑胺耐药机理研究[D];南京医科大学;2019年

2 杨召;甲基化调控J蛋白通过ATM/Chk2信号通路调控胶质母细胞瘤替莫唑胺耐药及机制研究[D];南方医科大学;2018年

3 史梦圆;替莫唑胺治疗无基因突变非小细胞肺癌脑转移疗效与安全的回顾性分析[D];郑州大学;2018年

4 贾骏;替莫唑胺通过血脑屏障能力的影响因素研究[D];贵州医科大学;2018年

5 潘雅娜;单纯全脑放疗与联合替莫唑胺治疗非小细胞肺癌脑转移灶疗效及安全性比较的Meta分析[D];遵义医学院;2018年

6 张敏;顺铂联合替莫唑胺治疗MGMT启动子甲基化胶质瘤的近期疗效观察[D];安徽医科大学;2018年

7 李齐印;替莫唑胺联合甲氨蝶呤治疗术后复发性中枢神经系统淋巴瘤的疗效分析[D];大连医科大学;2018年

8 杨志宽;替莫唑胺衍生物的抗肿瘤机制研究[D];昆明理工大学;2017年

9 唐东方;替莫唑胺衍生物治疗人脑胶质瘤的实验研究[D];苏州大学;2012年

10 陈正新;c-Myc-miR-29c-REV3L信号通路在人脑胶质母细胞瘤替莫唑胺获得性耐药中的作用及机制研究[D];南京医科大学;2016年

本文编号：2834095