Atg7调控纤连蛋白表达及其在血脑屏障形成中作用的初步研究

发布时间：2020-10-11 12:46

　　 背景及目的血脑屏障(BBB)是由具有紧密连接结构的脑微血管内皮细胞(BMEC)、基膜、周细胞、星形胶质细胞(足突)共同构成的结构,其中基膜在血脑屏障组装中起到不可或缺的作用。基膜主要由纤连蛋白(fibronectin,FN)、层连蛋白、Ⅳ型胶原、内肌动蛋白以及一些糖蛋白等组成,一般认为FN可介导基膜与周围细胞之间的黏附,对BBB的屏障作用的维持起着重要作用,但BBB基膜中FN的来源、表达调控机制及其在维系BBB中的详细机制,目前尚不清楚。近年来,不断增加的研究显示,细胞自噬参与了脑卒中的微血管病变过程,而且本人所在实验室的前期研究结果表明,细胞自噬的关键因子——自噬相关蛋白7(Autophagy-related protein 7,Atg7)在脑微血管发育中起重要作用,但Atg7与BBB基膜成分的关系,迄今尚未见文献报道。本文的主要目的是:在观察脑微血管发育过程中FN表达变化的基础上,借助模式细胞(人脑微血管内皮细胞,HBMEC)和Atg7血管内皮细胞条件性敲除小鼠,探讨Atg7与BBB基膜的主要成分FN表达的关系,为进一步探讨BBB的稳态维持积累科学资料。实验方法一、脑微血管发育过程中FN的表达变化利用Western blot检测脑发育过程FN的表达变化。二、利用血管内皮细胞Atg7条件性敲除小鼠,检测小鼠脑微血管内皮细胞中FN的表达和血脑屏障的通透性1.血管内皮细胞Atg7条件性敲除小鼠的制备和鉴定。2.用Atg7条件性敲除小鼠和野生对照小鼠制作脑震荡切片。3.利用组织免疫荧光法检测内皮细胞中FN表达水平。4.小鼠腹腔注射伊文思蓝,利用组织免疫荧光法检测Atg7条件性敲除小鼠和野生对照小鼠血脑屏障通透性。三、应用模式细胞(HBMEC)研究Atg7与FN表达的关系1.构建Atg7稳定干扰的HBMEC(人脑微血管内皮细胞)细胞株和对照细胞株。2.用Real-time PCR,Western blot以及细胞免疫荧光染色检测Atg7和FN的表达变化。四、Atg7调控FN表达机制的初步研究以信号通路抑制剂处理HBMEC,利用RT-qPCR检测不同抑制剂处理后的FN表达水平,以及抗p65抗体的免疫荧光(检测p65入核)方法以确定参与Atg7调控FN表达变化的信号通路。实验结果一、小鼠脑内FN表达随时间减少利用western blot检测出生后1、3、7、14、30、60天的小鼠大脑内FN的表达情况,结果显示:小鼠脑内FN表达的高峰出现在第14天,这与小鼠脑微血管发育的高峰期一致,提示脑内检测到的FN可能主要来源于脑微血管内皮细胞。二、在Atg7条件性敲除小鼠中,脑微血管内皮细胞中FN的表达下降,血脑屏障通透性升高用四个月龄的内皮细胞敲除Atg7(Atg7~(-/-))的小鼠和同窝野生对照小鼠,制作振荡切片,组织免疫荧光染色检测Atg7在血管内皮细胞中的表达。结果显示:与野生对照小鼠相比,CD31定位内皮细胞,Atg7条件性敲除小鼠中,其FN荧光亮度显著降低。三、人脑微血管内皮细胞中,干扰Atg7导致FN表达降低1.用Real-time PCR检测Atg7稳定干扰细胞株和对照细胞的mRNA表达水平,结果显示:与对照细胞株相比,干扰Atg7的表达后,FN的mRNA表达水平显著降低。2.用Western blot检测Atg7稳定干扰细胞株和对照细胞的总蛋白表达水平,结果显示:与对照细胞株相比,干扰Atg7表达后,FN的蛋白表达水平也显著降低。3.用细胞免疫荧光方法检测Atg7稳定干扰细胞株和对照细胞组分泌到胞外基质中的表达变化,结果显示:与对照细胞株相比,Atg7稳定干扰细胞株分泌到胞外基质的FN蛋白明显降低。四、NF-κB信号通路可能参与了Atg7导致的FN表达下调在信号通路抑制剂条件下使用RT-qPCR检测人脑微血管内皮细胞中FN转录水平,以及抗p65抗体的免疫荧光(检测p65入核)结果显示:NF-κB信号通路可能参与了Atg7导致的FN表达下调。结论与野生型对照小鼠相比,脑血管内皮细胞条件性敲除Atg7的小鼠,其脑微血管基膜中的FN的表达显著降低,血脑屏障通透性增加。体外培养的HBMEC中,干扰Atg7表达导致FN的mRNA和蛋白水平都显著降低,提示Atg7通过转录水平调控FN的表达。NF-κB信号通路可能参与了Atg7导致的FN表达下调。
【学位单位】：中国医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R743.3
【部分图文】：

3 实验结果天数的小鼠脑内 FN 的表达情况鼠发育过程中大脑内 FN 的表达情况。我们利用 wester3、7、14、30 以及 60 天的小鼠大脑内 FN 的表达情况。 FN 表达的高峰出现在第 14 天，这与小鼠脑微血管发育测到的 FN 可能主要来源于脑微血管内皮细胞。N）1 3 7 14 3060

图 2：鼠尾提取的 DNA 鉴定转基因鼠的基因型。鼠尾 DNA 经 PCR 扩增后，行琼脂糖凝胶电泳，本图的 1，2，4，5，6 为纯合型小鼠(Atg7-/-小鼠)。3.3 血管内皮特异性敲除 Atg7 的小鼠脑中 FN 表达水平显著降低，血脑屏障通透性显著升高我们采用免疫荧光对血管内皮特异性敲除 Atg7（Atg7-/-）的小鼠脑震荡切片中的 FN 表达水平进行检测，结果显示血管内皮特异性敲除 Atg7 的小鼠脑中 FN 的表达水平较野生鼠显著降低（图 3）。接下来，我们向小鼠体内注射 Evans Blue，30min后灌流取脑并进行冰冻切片，对血管内皮特异性敲除 Atg7 小鼠的血脑屏障通透性进行了分析，结果显示血管内皮特异性敲除 Atg7 小鼠的 Evans Blue 渗漏程度较野生鼠显著增加（图 4），这说明血管内皮特异性敲除 Atg7 小鼠的血脑屏障通透性与野生鼠相比显著升高。

图 2：鼠尾提取的 DNA 鉴定转基因鼠的基因型。鼠尾 DNA 经 PCR 扩增后，脂糖凝胶电泳，本图的 1，2，4，5，6 为纯合型小鼠(Atg7-/-小鼠)。血管内皮特异性敲除 Atg7 的小鼠脑中 FN 表达水平显著降低，血脑通透性显著升高我们采用免疫荧光对血管内皮特异性敲除 Atg7（Atg7-/-）的小鼠脑震荡切片中N 表达水平进行检测，结果显示血管内皮特异性敲除 Atg7 的小鼠脑中 FN 的表平较野生鼠显著降低（图 3）。接下来，我们向小鼠体内注射 Evans Blue，30min流取脑并进行冰冻切片，对血管内皮特异性敲除 Atg7 小鼠的血脑屏障通透性了分析，结果显示血管内皮特异性敲除 Atg7 小鼠的 Evans Blue 渗漏程度较野显著增加（图 4），这说明血管内皮特异性敲除 Atg7 小鼠的血脑屏障通透性与鼠相比显著升高。FN CD31 DAPI Merge
【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 ;Dynamic expression of extracellular signal-regulated kinase in rat liver tissue during hepatic fibrogenesis[J];World Journal of Gastroenterology;2006年39期

本文编号：2836609