胰岛素通过增加原代培养皮层神经元中锌-α2-糖蛋白的表达减轻癫痫氧化应激的研究

发布时间：2020-10-12 03:16

　　 目的:我们团队的前期研究发现癫痫患者及大鼠模型中ZAG表达降低,ZAG具有抑制癫痫的作用。胰岛素和过表达ZAG均可抑制癫痫发作和异常放电,既往研究发现ZAG可影响多种组织的胰岛素敏感性,但胰岛素是否调节ZAG的表达目前尚不清楚。癫痫中,氧化应激发挥了重要作用,而胰岛素和ZAG在多种疾病中均与氧化应激损害有关,但癫痫中ZAG是否具有抗氧化应激作用尚不清楚。本研究拟探讨胰岛素对原代培养皮层神经元中ZAG表达的影响及其机制,并探索胰岛素和ZAG在癫痫诱导的氧化应激中的作用。方法:1.提取并培养大鼠原代皮层神经元,用免疫荧光双标技术检测神经元中ZAG的表达;2.用不同浓度(0nM、10nM、50nM、100nM、200nM、500nM)的胰岛素干预皮层神经元,用MTS法测定不同浓度胰岛素对神经元活性影响,用RT-qPCR、Western blot测定不同浓度胰岛素干预条件下神经元中AZGP1 mRNA和ZAG表达量的变化,并通过AXL1717(IGF-1R拮抗剂)和BMS-754807(IR和IGF-1R拮抗剂)干预进一步探讨其作用机制;3.建立无镁细胞外液培养神经元癫痫模型,运用RT-qPCR、Western blot方法测定癫痫模型中AZGP1 mRNA和ZAG蛋白表达量的变化;4.验证LV的转染效果:将原代皮层神经元分为四个组分别转染慢病毒:过表达空载体组(Vector)、过表达组(LV-AZGP1)、低表达空载体组(LV-RNAi-Vector)、低表达组(LV-RNAi)。运用激光共聚焦显微镜观察、RT-qPCR及Western blot方法检测慢病毒转染效果;5.探索胰岛素及ZAG在癫痫诱导的氧化应激中的作用机制:将培养的神经元随机分为八个组,分别给予不同的处理:空白对照组(Control)、癫痫组(Seizure)、过表达空载体组(Vector)、过表达组(LV-AZGP1)、低表达空载体组(LV-RNAi-Vector)、低表达组(LV-RNAi)、胰岛素组(Insulin)、胰岛素+低表达组(Insulin+LV-RNAi)。激光共聚焦下观察超氧阴离子(O~(2-))的水平并统计。结果:1.免疫荧光结果显示ZAG在原代皮层神经元中有表达;2.MTS结果显示低于200nM的胰岛素处理对神经元的活性无影响,但500nM的胰岛素降低了神经元的活性(P0.05)。RT-qPCR和Western blot结果分别显示当浓度≤200nM时,胰岛素会增加神经元中AZGP1mRNA及ZAG水平,在200nM作用最明显。AXL1717或BMS-754807处理均可抑制胰岛素诱导的ZAG升高;3.RT-qPCR和Western blot结果分别显示在无镁癫痫模型中AZGP1mRNA及ZAG水平较对照组明显降低(P0.01);4.原代皮层神经元转染慢病毒后,绿色荧光结果显示神经元慢病毒转染成功,RT-qPCR及Western blot结果显示,与相应对照组相比,过表达组AZGP1 mRNA和ZAG在病毒转染72小时后显著增加(P0.01),低表达组AZGP1 mRNA和ZAG在病毒转染72小时后显著降低(P0.01);5.Seizure组超氧阴离子(O~(2-))产生增加,过表达AZGP1和胰岛素可减轻O~(2-)的产生,低表达AZGP1可增加O~(2-)的产生。与胰岛素组相比,Insulin+LV-RNAi组O~(2-)的产生明显增加。结论:在原代皮层神经元中,胰岛素主要通过作用于IGF-1R诱导ZAG表达增加。在神经元癫痫模型中,胰岛素发挥抗氧化应激作用可能是通过增高ZAG水平实现的。
【学位单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R742.1
【文章目录】：
英汉缩略语名词对照
中文摘要
abstract
前言
1 材料与方法
2 结果
3 讨论
全文总结
参考文献
文献综述：氧化应激在癫痫中的研究进展
    参考文献
致谢
攻读硕士学位期间发表论文和学术成果

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本文编号：2837555