炎症对胶质瘤细胞中线粒体生物学性能的影响

发布时间：2020-10-12 04:10

　　 研究背景及目的胶质瘤是成人原发性恶性脑肿瘤中最常见的类型,占所有原发性脑肿瘤和其他中枢神经系统肿瘤的28%。由于胶质瘤细胞的弥漫性浸润和对放化疗的抵抗性,将其归为致死性肿瘤。大约56.6%的胶质瘤患者为IV级星形细胞瘤,称为胶质母细胞瘤(Glioblastoma,GBM),这是一种高度侵袭性的肿瘤。GBM患者预后不佳,中位生存期仅为12-15个月。目前,GBM的主要治疗方法有手术治疗、放射疗法和化学疗法,虽然随着医疗技术的进步,GBM的治疗取得了一定的成果,但由于其高侵袭性、肿瘤细胞生长机制和发展的不明确性以及血脑屏障的存在,GBM的治疗仍然是一大难题。炎症和肿瘤的发生发展存在着重要的联系。它与肿瘤发生的各个阶段都有相关性,如细胞增殖、肿瘤转化、细胞对凋亡的逃避、细胞周期控制丧失、血管生成和转移。肿瘤细胞的一系列活动依赖于肿瘤微环境,肿瘤微环境中的重要组成部分是炎症因子,一系列细胞因子和趋化因子能够在炎症反应中产生,这些因子在促进肿瘤的转移和侵袭方面起重要的作用。并且,炎症因子的聚集,在很大程度上能够促进肿瘤细胞通过基质细胞,从而促进肿瘤的转移。线粒体是真核生物细胞内高度动态的细胞器,其大小、形态、运动、定位和周转的变化,与其适应性和功能性改变、质量控制和体内平衡都密切相关。线粒体呈现出长丝状的网络结构,当其在整个细胞质中向各个方向运动时,可以看到延伸、收缩、断裂和融合,并且该特征对于维持线粒体相关的生物活动是必需的,例如细胞生长、分裂、凋亡、衰老和疾病。线粒体直接或间接涉及肿瘤细胞代谢的许多方面。已经有报道显示,在各种实体瘤和血液恶性肿瘤中,涉及多种线粒体的改变。尽管目前许多研究已提出多种机制来解释肿瘤细胞的线粒体动力学,但没有研究来评估炎症对胶质瘤线粒体的影响。所以探讨胶质瘤中线粒体的功能和形态变化对于解答胶质瘤的发生与发展机制非常重要。因此,本研究通过透射电镜、生物信息学、免疫组化、ELISA、细胞培养、免疫荧光和流式细胞术等主要实验技术手段研究了胶质瘤中线粒体的形态和生物学性能,以及炎症对于胶质瘤细胞中线粒体的影响及对细胞自身的影响,为探讨胶质瘤的发病机制及探寻有效的治疗手段提供依据。材料和方法第一部分:胶质瘤组织中的线粒体的代谢异常以及炎症因子的改变1.对胶质瘤组织进行固定处理,通过透射电镜观察线粒体的形态学改变。2.下载CGGA中的胶质瘤数据,筛选出与糖酵解、电子传递链和三羧酸循环相关酶的基因表达数据,统计分析与代谢相关的酶的基因表达改变及病人生存分析;下载与炎症相关因子的基因表达数据,统计分析胶质瘤中炎症相关因子的基因表达改变及其与代谢相关酶的表达相关性。3.对胶质瘤组织和癌旁组织进行HE和小胶质细胞标志物Iba1免疫组化染色,观察胶质瘤组织中的炎症细胞的浸润和小胶质细胞的活化情况。4.通过人类蛋白图谱(http://www.proteinatlas.org/)中提供的胶质瘤中蛋白表达的信息,统计分析线粒体上4种电子传递链复合体的各个亚基在胶质瘤中的表达变化。第二部分:炎症对胶质瘤细胞中线粒体生物学性能的影响1.用炎症因子LPS+IFN-γ联合刺激胶质瘤细胞,根据刺激时间分为0 h(刺激前)、4 h、8 h和24 h组,首先用ELISA的方法检测细胞上清液中的炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α和IL-4的表达情况;接下来用免疫荧光和透射电镜的方法观察胶质瘤细胞中的线粒体的形态和亚显微结构的改变;用WB检测与线粒体分裂与融合相关的Drp1、Mfn2与Hsp60蛋白表达情况。2.使用MitoSOX-Red检测LPS+IFN-γ刺激后胶质瘤细胞中mtROS的改变。3.使用线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)检测LPS+IFN-γ刺激后胶质瘤细胞中线粒体膜电位的改变。4.使用WB检测与糖酵解、电子传递链和三羧酸循环相关酶的蛋白表达情况,检测LPS+IFN-γ刺激后胶质瘤细胞中代谢重编程的改变。5.用LC 3B标记细胞自噬,使用WB和细胞免疫荧光检测在LPS+IFN-γ联合刺激后胶质瘤细胞中自噬水平的变化。6.用CCK8检测在LPS+IFN-γ联合刺激后,胶质瘤细胞活力的改变;使用Ki-67标记增殖细胞,检测在LPS+IFN-γ联合刺激后,胶质瘤细胞增殖的改变;使用Annexin V FITC/PI双标法检测在LPS+IFN-γ联合刺激后,胶质瘤细胞凋亡的情况。研究结果1.通过透射电镜我们观察到胶质瘤组织中线粒体发生肿胀、基质空泡化、嵴破坏甚至消失。2.统计分析CGGA数据库中与代谢相关以及炎症因子相关的基因表达数据,结果显示:与LGG相比,GBM中与糖酵解相关酶HK1、LDHA和GAPDH的基因表达增加,并且高表达能够降低患者的生存率;与三羧酸循环和电子传递链相关酶CS和ATP5A的基因表达降低,并且低表达能够降低患者的生存率。GBM中多种炎性因子的表达也发生了改变,炎性因子IL-6、IL-8、IL-4和IL-10与糖酵解相关酶HK1、LDHA和GAPDH的表达呈现正相关,与三羧酸循环和电子传递链相关酶CS和ATP5A的表达呈现负相关。3.胶质瘤组织和癌旁组织的HE染色结果显示胶质瘤组织中存在坏死区,并有大量炎症细胞浸润,Iba1免疫组化染色显示小胶质细胞活化,胞体增大,突起回缩。4.统计分析人类蛋白图谱中线粒体上4种电子传递链复合体的各亚基的表达,结果显示多个亚基的表达均发生了明显改变;此外,我们通过免疫组化检测了胶质瘤组织中NADH脱氢酶的亚基Subunit 6、琥珀酸脱氢酶的亚基SDHB以及细胞色素C氧化酶的亚基COX6B1的表达变化情况,结果显示:与癌旁组织相比,COX6B1显著增加;与正常脑组织相比,SDHB和Subunit 6的表达显著降低。5.用LPS+IFN-γ联合刺激胶质瘤细胞后,1)细胞上清液中炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α和IL-4的表达均出现不同程度的改变;2)U118-MG细胞线粒体发生了断裂,断裂的线粒体为球状、环状或C状;在电镜下观察,线粒体发生了肿胀、基质空泡化、嵴消失、并出现C形线粒体;3)WB结果显示Hsp60未发生明显改变,Drp1表达增加,Mfn2表达降低。6.用LPS+IFN-γ联合刺激胶质瘤细胞后,U87-MG中mtROS在4 h和8 h时增加,24 h降低;U118-MG中mtROS无明显改变。胶质瘤细胞U118-MG的线粒体膜电位在刺激后显著降低。7.用LPS+IFN-γ联合刺激胶质瘤细胞U87-MG后,与糖酵解相关的HK1和LDHA在8 h均有显著性增加;与三羧酸循环相关的CS在刺激后均有显著性增加;电子传递链复合体亚基COX6B1和SDHB在细胞处理8 h和24 h时均有显著性降低,ATP5A则无明显改变。8.用LPS+IFN-γ联合刺激胶质瘤细胞后,线粒体的自噬水平、细胞活力和增殖均无明显改变,而细胞凋亡显著性降低。结论1.胶质瘤中,线粒体形态结构异常,代谢发生重编程,存在炎症反应,并且代谢与炎症间具有相关性。2.炎症可破坏胶质瘤细胞线粒体的形态结构的完整性,增加mtROS,降低线粒体膜电位;胶质瘤细胞对于炎症引起的线粒体异常具有耐受性。
【学位单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R739.41
【部分图文】：

图 1 TEM 检测胶质瘤组织细胞中线粒体亚显微结构的变化a 图：基质空泡化、嵴消失；b 图为 a 图方框区域的放大图；c 图：线粒体肿胀、基质空泡状、嵴破坏和消失；d 图为 c 图放大图 M：线粒体；N：细胞核；红色箭头指示线粒体嵴2.2 胶质瘤中与代谢重编程相关的酶的基因表达的改变肿瘤的标志之一是代谢途径和模式发生了改变，亦被称为代谢重编程（Metabolic Reprogramming）。代谢重编程会导致肿瘤细胞对凋亡的逃避，促进其增殖和存活，并促进肿瘤发展和转移[37]。上述结果提示胶质瘤组织细胞中的线粒体功能可能受到显著影响。因此，我们接下来分析细胞代谢过程中相关酶的改变。我们下载 CGGA 数据库中胶质瘤数据，汇总数据库中各种肿瘤类型（表 1）。首先筛选与糖酵解相关的酶的基因表达数据，包括己糖激酶 1（Hexokinase1,HK1）、乳酸脱氢酶 A（Lactate Dehydrogenase A, LDHA）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase, GAPDH）。数据分析结果显示：与 LGG 相比较，GBM 中 HK1、LDHA 和 GAPDH 的 mRNA 表达水平均有显著性增加（图 2A-C）；并且，对于三种酶的表达以中位数为界分为高表达组与低表达组，进行生存分析，发现 LDHA 和 GAPDH 的表达水平对患者的生存时间有显

表 1 CGGA 数据库中各种肿瘤类型汇总Database Histology Grade SamplesCGGAAstrocytomas (A) Ⅱ 60Oligodendrogliomas (O) Ⅱ 19Oligoastrocytomas (OA) Ⅱ 37Anaplastic Astrocytomas (AA) Ⅲ 15Anaplastic Oligodendrogliomas (AO) Ⅲ 12Anaplastic Oligoastrocytomas (AOA) Ⅲ 22GBM Ⅳ 125

13图 3 胶质瘤组织中与氧化磷酸化和三羧酸循环相关酶的 mRNA 的表达情况（CGGA）A、B 图：CS 和 ATP5A 的 mRNA 表达情况；C、D 图：CS 和 ATP5A 对病人生存影响的分析 ***： P < 0.0012.3 胶质瘤组织中炎症因子基因表达的改变肿瘤微环境中存在多种炎症因子，包括促炎因子 IL-1β、IL-6、白细胞介素-8（Interleukin-6, IL-8）和 TNF，以及抑炎因子白细胞介素-1α（Interleukin-1α, IL-1α）、白细胞介素-4（Interleukin-4, IL-4）、白细胞介素-10（Interleukin-10, IL-10）和白细胞介素-13（Interleukin-13,IL-13）。在 CGGA 数据库中筛选出这些炎症因子的基因表达情况，统计分析结果显示：胶质瘤组织中的多种炎症因子表达发生了改变，与 LGG 相比，GBM 中的促炎因子 IL-6 和 IL-8 显著性增加，TNF 显著性降低，IL-1β 无明显改变（图 4A-D）；抑炎因子 IL-4、IL-10 和 IL-13 在 GBM中亦显著性增加，IL-1α 无明显改变（图 4E-H）。炎症因子基因表达的改变提示胶质瘤组织中可能存在有炎症反应！线粒体的代谢重编程是否与炎症反应相关
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本文编号：2837620