ATP1A1对人胶质瘤干细胞增殖和凋亡的影响及机制研究

发布时间：2020-10-12 17:11

　　 背景:胶质母细胞瘤(GBM)是最常见的原发性恶性脑肿瘤,具有增殖迅速、侵袭性强、治疗效果差、复发率高、生存期短等特点。目前针对脑肿瘤的基础研究取得了很大进展,但这些进展并没有显著改善患者的预后,在传统治疗干预的情况下GBM患者的平均总生存期只有15个月左右。胶质瘤干细胞(GSCs)自被发现以来已被广泛研究,尽管GSCs在胶质瘤中只是数量极少的一个亚群,但其显著区别于普通的肿瘤细胞,因其具有自我更新、无限增殖、多向分化和重建肿瘤的潜能,是维持并促进肿瘤生长的关键,在一定意义上决定着肿瘤的化疗耐药和肿瘤复发。因此,靶向GSCs可能为高级别胶质瘤病患提供更有效的治疗方法。为了解胶质瘤干细胞区别于分化的普通胶质瘤细胞的特异性分子机制,我们前期使用iTRAQ联合2D LC-MS/MS的蛋白组学技术对比分析了胶质瘤干细胞相对于其分化细胞的特异性的差异蛋白,发现ATP1A1在GSCs中异常高表达,可能是靶向胶质瘤干细胞的潜在靶点。方法:在本研究中,为了进一步了解ATP1A1在原代人GSCs的恶性表型和发病机制中的作用,我们首先分离培养出原代人胶质母细胞瘤干细胞并对其进行贴壁培养,检测了不同等级胶质瘤中ATP1A1的表达,检测了GSCs及分化的GBM细胞中ATP1A1的表达,最终选择两株原代GSCs用于后续的研究。随后构建了ATP1A1慢病毒干扰的GSCs,并检测干扰组(sh-ATP1A1 GBM GSCs)和对照组(sh-NC GBMGSCs)增殖及凋亡和体内成瘤的能力的变化;检测sh-ATP1A1GBM GSCs/sh-NC GBMGSCs中MAPK和PI3K信号通路变化并检测到ATP1A1作用于MAPK和PI3K信号通路的重要节点Src;检测ATP1A1与Src的互作关系及干扰ATP1A1表达后Src磷酸化水平的变化;最后利用sh-Src慢病毒,在恢复了ATP1A1表达的GSCs中干扰Src的表达,检测Src下调后细胞的增殖和凋亡能力的变化。结果:我们从人原代胶质母细胞瘤组织中成功分离出胶质瘤干细胞,并可通过预涂层粘连蛋白和多聚赖氨酸使GSCs单层贴壁培养,通过验证发现细胞具有二次成球能力并表达干细胞的标志物SOX2和NESTIN;诱导分化后细胞表达分化标志物GFAP。另外我们发现ATP1A1更优先表达于高级别的胶质瘤中,且相对于胶质瘤细胞,其干细胞中ATP1A1表达显著上调;敲低ATP1A1后,GSCs增殖受到抑制,细胞周期阻滞,凋亡增加,体内成瘤能力下降;p-AKT、p-ERK1/2活性降低;Src为ATP1A1调控AKT和ERK的关键节点;且ATP1A1与Src有直接或间接的互作关系,ATP1A1下调后GSCs中Src活化水平也随之下调;最后恢复ATP1A1表达的GSCs中下调Src的表达以后,细胞表现为增殖抑制、凋亡增加。结论:ATP1A1在GSCs中高表达并可调控GSCs的增殖和凋亡,其可能通过与Src直接或间接互作影响Src的磷酸化水平从而调控Src介导的MAPK和PI3K信号通路活性,从而影响细胞的增殖与凋亡。
【学位单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R739.4
【部分图文】：

18 1.1 胶质瘤干细胞的成球、贴壁生长与分化 A：胶质瘤干细胞（GBM GSCs1 和 GBMCs2）的悬浮成球生长，具有成球能力（100×） B：胶质瘤干细胞的贴壁生长（200×） C：胶质瘤干细胞分化细胞（GBM1 和 GBM2）的生长（100×）。Figure 1.1 Stem cell spheres, adherent growth and differentiation of glioma stem cellsA: Suspendedspheresof glioma stem cells (GBM GSCs) (100×) B: Adherent growth ofglioma stem cells (200×) C: Growth of glioma stem cell differentiated cells (100×).2 胶质瘤干细胞免疫荧光鉴定

重庆医科大学博士研究生学位论文SOX2 和 NESTIN 是最被广泛认可的胶质瘤干细胞标志物，我们对胶质瘤贴壁干细胞进行SOX2和NESTIN的免疫荧光染色，以便观察单个细胞的染色状态，在激光共聚焦显微镜下我们可观察到胶质瘤干细胞红色膜染色和绿色核染色，表明该细胞可共表达 SOX2 和 NESTIN (图 1.3)，同时也验证了所培养出来的细胞为胶质瘤干细胞。

胶质瘤干细胞分化细胞分化标志物GFAP免疫荧光鉴定标尺，50μm
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本文编号：2838044