目的:脑卒中是大多数西方国家继缺血性心脏病之后的第二位死亡原因,但是在中国,脑卒中已成为居民的首位死因。中国每年约有160万人死于脑卒中,已成为严重影响国计民生的重要公共卫生问题。高血压是脑卒中发病的最重要危险因素,我国高血压人群基数十分庞大,与脑卒中关系密切,因此,高血压人群是脑卒中一级预防最重要的目标人群。随着技术的发展,代谢组学逐渐在心脑血管疾病领域表现出其应用潜力。越来越多的研究发现血浆代谢产物与高血压或脑卒中之间存在显著的关联。如果在我国高血压人群中能够找到一种或一组敏感而且特异的代谢标志物来预示脑卒中的发生,必将对脑卒中的一级预防产生巨大影响。高血压发展为脑卒中是一个较长的过程,在这个时间内,心脑血管系统可能发生多种变化,最终导致卒中。其中,氧化应激过程被认为是脑卒中发生的重要机制之一,干预氧化应激过程可以起到预防或治疗脑卒中的作用。然而,目前国内外尚无高血压人群并发脑卒中的代谢组学研究,亦缺乏相关机制的报道。高血压所致卒中机制复杂,不同于单纯脑卒中,且中国高血压人群脑卒中发生率明显高于欧美人群,现有的证据均不能充分解释这种差异。因此,本研究首先利用既往已建立的队列,探索东北地区2004年-2016年高血压人群脑卒中发病的流行趋势,然后进一步以脑卒中作为唯一终点事件,通过巢式病例对照研究分析血浆非靶向代谢组学与高血压脑卒中的发病关系,旨在找到一组与高血压并发脑卒中相关的代谢物,最后在细胞和动物实验中探讨代谢物是否通过氧化应激机制影响脑卒中的发病。研究方法:第一部分:利用既往在辽宁省农村地区已建立的两个自然人群队列三次随访数据(2004-2008年、2008-2010年及2013-2016年),收集新发脑卒中病例,计算年龄调整的脑卒中人年发病率,使用Cox比例风险模型计算年龄调整的脑卒中发病率的风险比(hazard ratio,HR)和95%可信区间(confidence interval,CI),分析2004年-2016年东北地区高血压人群脑卒中的发病趋势。第二部分:在课题组前期建立的队列中选取符合条件的高血压患者,随机抽取90例高血压并发脑卒中病例,并按照1:1匹配,从该队列中随机选取同等随访期限且未发生脑卒中的符合匹配条件的研究对象作为对照。采用超高效液相色谱-质谱联用法,从正离子和负离子两种电离模式,对所有纳入病例的基线血浆进行非靶向代谢组学检测。原始数据转换后,进行单变量和多变量统计分析,并利用受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC)分析、通路富集分析等方法,筛选与高血压脑卒中发病相关的代谢物及其通路。第三部分:根据前一部分筛选结果,选取差异代谢物植物鞘氨醇进一步实验。分别5μM、10μM及50μM浓度的植物鞘氨醇处理人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)24h,通过CCK8检测细胞活性。再用植物鞘氨醇5μM、10μM及50μM处理细胞24h并且给与H_2O_2 500μM处理12h,采用CCK8检测细胞活性,Western blot检测氧化应激指标丙二醛(MDA)和内质网应激指标葡萄糖调节蛋白78(GRP78)的表达水平。进一步选取8周龄雄性卒中易感型自发性高血压大鼠(SHRSP)进行实验。SHRSP大鼠16只随机分为两组,实验组给与生理盐水+植物鞘氨醇(0.01mg/g)+10%DMSO(SHRSP-PHS组,n=8),对照组给与生理盐水+10%DMSO(SHRSP-Con组,n=8),灌胃8周,另选取性别与周龄匹配的Wistar大鼠作为正常对照组(WKY组,n=8)。所有大鼠均给与日本高盐低钾饲料配方喂养,以加速脑卒中发生。尾套法测量大鼠收缩压,ELISA法检测干预4周和8周的血浆MDA和过氧化物歧化酶(SOD)水平,记录大鼠脑卒中临床表现评分,大体及HE染色观察大鼠脑组织结构变化。结果:第一部分:本研究纳入人群包括2004-2008年队列(13,626名高血压患者)、2008-2010年队列(13,241名高血压患者)和2013-2016年队列(4,321名高血压患者)。男性中,年龄标化的脑卒中人年发病率由2004年的686/10万增长到2008年的1362.6/10万和2013年队列的1760.4/10万。女性中同样,脑卒中人年发病率由2004年的563.3/10万增长到2008年的617.2/10万和2013年的1386.3/10万,均呈明显上升态势。相比2004年,2008-2010年男性高血压患者脑卒中发病率增长了79.8%(HR和95%CI:1.798,1.427-2.264),2013-2016年脑卒中发病率增长了162.3%(HR和95%CI:2.623,2.013-3.418)。在女性中,与2004年相比,2013-2016年脑卒中发病率增长了172.5%(HR和95%CI:2.725,2.027-3.662)。其中,主要的增长均来自缺血性脑卒中。第二部分:病例组与对照组的年龄、性别和基线血压分级构成一致。两组之间体质指数、腰围、总胆固醇、甘油三酯、低密度和高密度脂蛋白、空腹血糖、吸烟及饮酒率亦无差异(P均0.05)。非靶向代谢组学整体数据质量良好,在有明确定性信息的有效代谢物中,正离子模式下运用CARS法筛选出了121个代谢物,负离子模式下筛选出了66个代谢物。高血压并发脑卒中的患者血浆代谢产物明显不同于未发生脑卒中的患者。应用PLS-DA模型的VIP值1且单变量分析P0.05作为筛选标准,共筛选出16个内源性差异性代谢物,其中7个代谢物下调,包括2-甲基二氢吡咯、DL-二氢鞘氨醇、植物鞘氨醇、辛酰基溶血磷脂酰胆碱、油酰乙基酰胺、5β-雄甾烷-3α-醇-17-酮硫酸盐和甘油,9个代谢物上调,包括DL-吲哚-3-乳酸、十五酰基溶血磷脂酰胆碱、亚麻酰基溶血磷脂酰胆碱、蓖麻酸甲酯、2-哌啶甲酸、棕榈酸单甘油酯、花生四烯酸甲酯、1α-羟基-25,26,27-去三甲基补骨脂素24-羧酸和四氢醛固酮。所构建预测模型用于区分高血压脑卒中与非脑卒中的ROC曲线下面积为0.843,95%CI为0.788-0.898。相关代谢通路包括鞘脂代谢、甘油脂代谢、甘油磷脂代谢、半乳糖代谢、苯丙氨酸代谢及色氨酸代谢。亚组分析提示缺血性脑卒中的差异代谢物及代谢通路有一部分区别于整体脑卒中。第三部分:细胞实验:植物鞘氨醇5μM、10μM及50μM三个浓度对HUVEC细胞增殖活力均没有显著影响。用植物鞘氨醇预处理后,H_2O_2诱导的细胞损伤明显缓解,并且随着浓度的增加,细胞活力逐渐升高。500μM H_2O_2处理HUVEC细胞12h后,细胞MDA水平明显增高。相比对照组,植物鞘氨醇干预组(5μM、10μM及50μM)细胞MDA的产生减少,并随着植物鞘氨醇浓度的增加而递减,同时,内质网应激蛋白GRP78的产生也明显减少。动物实验:随着大鼠周龄的增长,各组动物体重均有增加,三组大鼠体重无显著性差异。灌胃8周后,SHRSP-PHS和SHRSP-Con组大鼠血压分别为228±7 mmHg和226±9 mmHg,两组之间收缩压无显著性差异(P0.05)。干预4周后,SHRSP-PHS和SHRSP-Con组血浆MDA及SOD水平未见统计学差异。干预8周后,与SHRSP-Con组相比,SHRSP-PHS组血浆MDA水平显著降低(P0.05),SOD水平显著升高(P0.05),随访至干预8周后,SHRSP-Con和SHRSP-PHS组分别有3只和2只大鼠死亡。干预8周后WKY组无大鼠发生卒中,SHRSP-PHS组和SHRSP-Con组均100%发生临床卒中。SHRSP-Con组脑组织出血和缺血性改变多于SHRSP-PHS组。与SHRSP-Con组相比,SHRSP-PHS组临床卒中评分有下降趋势。结论:本研究首次发现近十年,东北农村地区高血压人群脑卒中发病呈快速上升趋势,男性发病率始终高于女性,总发病率较十年前增长了约1.6倍,缺血性脑卒中发病率较十年前增加了3倍左右,出血性脑卒中发病率未见明显增长。高血压未来发生脑卒中的患者血浆代谢图谱明显区别于未发生脑卒中的患者,多种代谢物及代谢通路可能参与高血压脑卒中的发病过程,这些代谢物的组合可以较好的预测高血压脑卒中的发生。其中,植物鞘氨醇能够改善SHRSP大鼠脑的结构与功能,改善临床脑卒中症状,并且可能通过抗氧化应激损伤的机制起到保护脑卒中的作用。本研究为高血压脑卒中的预防和机制探索提供了新的方向。
【学位单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R743.3;R544.1
【部分图文】：
图 2. 不同性别年龄标化的脑卒中人年发病率 2004 年-2016 年东北地区高血压人群脑卒中发病风险相比 2004年，2008-2010 年男性高血压患者脑卒中发病率增长了 79.8% CI: 1.798, 1.427-2.264)，2013-2016 年脑卒中发病率增长了 162.3% (HR a2.623, 2.013-3.418)，见表 3 。在女性中，与 2004 年相比，2013-2016 年
中国医科大学博士学位论文3 结果3.1 研究对象纳入流程及基本资料本研究基于 NCRCHS 人群，平均随访 4.52 年。纳入了其中的 6,211 名基线高血压患者，有 266 名患者因缺失联系方式等原因而被排除，对余下的 5,945 名患者进行随访，排除 1,134 名基线已有心血管疾病的病例以及 769 名基线血压控制良好或血标本无法应用的病例，最终，共有 4,042 名高血压患者满足纳入标准，在所有新发脑卒中病例中随机抽取 90 例，并按 1:1 匹配 90 例未发生脑卒中的病例，构成巢式病例对照研究，进行血浆非靶向代谢组学检测，（图 1）。
各组代表性样本的总离子流图
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本文编号：
2838520
