背景胶质瘤是中枢系统最常见的恶性肿瘤,严重危害人体健康。目前针对胶质瘤的治疗虽然有一定的效果,但由于胶质瘤的侵袭性生长特性,与周围脑组织分界不清,手术很难完全切除。然而由于胶质瘤耐受性等治疗的局限性,放疗和化疗疗效有限,尤其是高级别神经胶质瘤,复发率高,预后差,中位生存期不足一年。近年来分子水平的基因治疗是胶质瘤治疗和研究的新方向。通过抑制信号传导通路的异常激活,进而调控细胞周期,可有效促进肿瘤细胞凋亡及抑制肿瘤细胞增殖。因此,深入研究胶质瘤的发生发展机制,找到针对胶质瘤的有效治疗靶点,对于延长胶质瘤患者的生存期及提高生活质量有重要意义。Notch受体是一种Ⅰ型跨膜受体蛋白,在进化上高度保守,对细胞的生长、分化、增殖、凋亡起着不可替代的作用。在Notch受体结构中,共存在Notch1-4四种受体,它们的生物学功能是存在差别的,甚至截然相反。证据表明,Notch受体表达异常与恶性肿瘤的发生密切相关。在中枢神经系统肿瘤的发生中,Notch既可发挥促癌作用,又可发挥抑癌作用,这是由于Notch存在不同的同源受体。Notch 3基因被确认为哺乳动物的第三个缺口,最初被描述为在增殖的神经上皮中表达。国外有研究发现,Notch3基因在胶质瘤细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡等方面发挥着癌基因的作用并具有预后判断价值,可作为高级别胶质瘤基因治疗的分子靶标,而国内有关Notch3受体在胶质瘤发生发展中的作用及相关分子机制研究鲜见报道。目的为了探讨Notch3信号通路在胶质瘤发生发展中的作用,本研究首先检测胶质瘤组织中Notch3 mRNA及蛋白的表达,以及Ki-67、Bcl-2、Caspase3蛋白的表达,分析Notch3与胶质瘤发生发展及增殖、凋亡的关系。其次通过检测胶质瘤组织中IDH基因突变状态,分析Notch3与预后相关因子IDH的关系。最后通过Notch3受体抑制剂,抑制胶质母细胞瘤细胞株U87、U251中Notch3的表达,分析Notch3对肿瘤细胞增殖、侵袭、凋亡的影响。以期在分子水平上阐明Notch3在胶质瘤发生和发展中的作用,为其临床治疗提供科学依据。方法(1)采用实时荧光定量PCR的方法检测40例胶质瘤新鲜标本(弥漫性星形或少突胶质细胞肿瘤)和10例正常脑组织新鲜标本中Notch3 mRNA的表达情况。(2)采用免疫组织化学方法检测80例胶质瘤组织(弥漫性星形或少突胶质细胞肿瘤)及49例胶质细胞增生组织中Notch3、Ki-67、Bcl-2及Caspase3蛋白的表达情况,分析Notch3与Ki-67、Bcl-2及Caspase3蛋白表达的关系。(3)采用基因测序的方法检测80例胶质瘤组织(弥漫性星形或少突胶质细胞肿瘤)中IDH基因突变状态,分析Notch3蛋白表达与IDH基因突变的关系。(4)将不同剂量的Notch3受体抑制剂DAPT加入胶质母细胞瘤细胞株U87及U251中,运用实时荧光定量PCR及western blot方法检测Notch3的抑制效果。根据抑制剂剂量及抑制效果将细胞分为三组:对照组、Notch3低表达1组(Low-1)、Notch3低表达2组(Low-2)。(5)Notch3受体抑制后,采用CCK-8细胞增殖实验检测U87及U251细胞对照组、Low-1组、Low-2组增殖能力的变化,运用分光光度仪检测细胞在450nm波长的吸光度。(6)Notch3受体抑制后,采用Transwell侵袭小室实验检测U87及U251细胞对照组、Low-1组、Low-2组侵袭能力的变化,倒置显微镜观察细胞形态学改变。(7)Notch3受体抑制后,采用AnnexinV-FITC/PI方法检测U87及U251细胞对照组、Low-1组、Low-2组凋亡能力的变化,在荧光显微镜下观察细胞的变化。结果(1)40例胶质瘤新鲜组织中,Notch3 mRNA的表达水平为2.26士1.60,明显高于正常脑组织(0.95士0.69,P0.05)。(2)80例胶质瘤组织中,Notch3蛋白阳性表达率(55.00%)明显高于胶质细胞增生组织(36.70%,P0.01);在≥60岁患者中的阳性表达率(75.00%)明显高于60岁患者(48.33%,P0.05);与胶质瘤组织学分级(ⅡvsⅢvsⅣ:31.81%、55.00%、68.42%)呈正相关(P0.05);而与患者的性别无关(P0.05)。(3)80例胶质瘤组织中,Ki-67蛋白阳性表达率(63.75%)明显高于胶质细胞增生组织(14.28%,P0.01);与胶质瘤组织学分级(ⅡvsⅢvsⅣ:27.27%、60%、86.84%)呈正相关(P0.05);而与患者的年龄、性别无关(P0.05)。(4)80例胶质瘤组织中,Bcl-2蛋白阳性表达率(58.75%)明显高于胶质细胞增生组织(46.90%,P0.01);与胶质瘤组织学分级(ⅡvsⅢvsⅣ:31.81%、60.00%、73.68%)呈正相关(P0.05);而与患者的年龄、性别无关(P0.05)。(5)80例胶质瘤组织中,Caspase3蛋白阳性表达率(38.75%)明显低于胶质细胞增生组织(57.29%,P0.01);与胶质瘤组织学分级(ⅡvsⅢvsⅣ:68.18%、30.00%、26.31%)呈负相关(P0.05);而与患者的年龄、性别无关(P0.05)。(6)胶质瘤组织中,Notch3蛋白表达与Ki-67呈正相关(r=0.347,P0.01),与Bcl-2呈正相关(r=0.272,P0.01),而与Caspase3呈负相关(r=-0.315,P0.01)。(7)80例胶质瘤组织中,IDH基因突变率为36.25%;在60岁患者中的突变率(45.00%)明显高于≥60岁患者中的突变(10.00%,P0.05);与胶质瘤组织学分级(ⅡvsⅢvsⅣ:63.63%、45.00%、15.78%)呈负相关(P0.05);而与患者的性别无关(P0.05);胶质瘤组织中,IDH基因突变与Notch3蛋白表达呈负相关(P0.01)。(8)Notch3受体抑制剂DAPT加入U87、U251细胞后,与对照组相比,Low-1组、Low-2组Notch3 mRNA(U87:1.00士0.00 VS 0.45士0.07 VS 0.22士0.05;U251:1.00士0.00 VS 0.52士0.15 VS 0.19士0.08)及Notch3蛋白(U87:0.83士0.06 VS 0.61士0.09 VS 0.36士0.07;U251:0.85士0.08 VS 0.57士0.03VS 0.31士0.04)表达明显下调(P0.05)。(9)Notch3受体抑制剂DAPT加入U87、U251细胞后,与对照组相比,Low-1组、Low-2组细胞增殖能力(U87:1.70士0.03 VS 1.37士0.07 VS 0.99士0.11;U251:1.51士0.05 VS 1.30士0.05 VS 0.89士0.10)明显减弱(P0.05)。(10)Notch3受体抑制剂DAPT加入U87、U251细胞后,与对照组相比,Low-1组、Low-2组细胞侵袭能力(U87:75.00士11.53 VS 33.50士6.28 VS 14.67士2.08;U251:61.50士10.69 VS 32.33士6.51 VS 12.00士3.61)明显减弱(P0.05)。(11)Notch3受体抑制剂DAPT加入U87、U251细胞后,与对照组相比,Low-1组、Low-2组细胞凋亡率(U87:8.80士3.03 VS 22.40士3.05 VS 47.00士4.64;U251:6.60士3.36 VS 20.20士4.21 VS 42.40士5.86)明显升高(P0.05)。结论(1)Notch3基因在胶质瘤组织中过度表达,而在正常组织中不/低表达,提示Notch3激活表达与胶质瘤的发生发展有关。(2)胶质瘤组织中,Notch3蛋白表达与Ki-67、Bcl-2呈正相关,而与Caspase3、IDH呈负相关,提示Notch3表达可能与胶质瘤的增殖、凋亡及预后相关。(3)胶质瘤细胞中,下调Notch3表达,可抑制细胞增殖、侵袭,促进细胞凋亡,提示Notch3与胶质瘤细胞的增殖、侵袭、凋亡相关。
【学位单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R739.4
【部分图文】：
果Notch3 mRNA 在胶质瘤组织和相对正常脑组织中的表达探究 Notch3 在胶质瘤中的表达水平，我们首先在 mRNA 水平比较了脑胶质瘤组织与相对正常脑组织的表达差异性。采用 qRT-PCR 方法质瘤组织新鲜标本和 10 例相对正常脑组织新鲜标本。结果显示：胶 Notch3 mRNA 的表达水平为 2.26 士 1.60，明显高于相对正常脑组织（，P<0.05）（图 1）。
胞浆和细胞膜，棕黄色或浅黄色（图 2.1 A）；80 例脑胶质瘤组织中有 46 例阳性表达，阳性率 55.00 %。在相对正常脑组织中，Notch3 蛋白的阳性表达着于细胞浆和细胞膜，浅黄色（图 2.1 B）；49 例中有 18 例呈阳性表达，阳性36.70 %。二者相比，Notch3 蛋白在人脑胶质瘤组织中的表达明显高于相对正脑组织。差异有统计学意义（χ2= 23.051，P<0.05，表 2.1）。A B
图 3.1 Ki-67 蛋白在胶质瘤组织和相对正常脑组织中的表达A：瘤组织（200×）；B：相对正常组织（200×）表 3.1 Ki-67 蛋白在胶质瘤组织和相对正常脑组织中的表达部位 例数Ki-67χ2P－ +正常 49 42 7 30.045 0.0胶质瘤 80 29 514.3.2 Ki-67 蛋白在脑胶质瘤组织中的表达与临床病理参数的关系80 例脑胶质瘤组织中，男性 45 例，女性 35 例，Ki-67 蛋白在男性患者中阳性率为（53.33 %，24 / 45），在女性患者中的阳性率为（77.14 %，27 / 35）二者相比，差异无统计学意义（χ2= 0.830，P>0.05，表 3.2）。80 例脑胶质瘤组织中，年龄≥60 岁共 20 例，年龄<60 岁共 60 例。Ki-67 白在<60 岁患者中的阳性率为（63.33 %，38 / 60），在≥60 岁患者中的阳性率
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