朊病毒病患者脑脊液特异性tau蛋白ELISA方法的建立及初步应用

发布时间：2020-10-17 15:19

　　 朊病毒(Prion Disease,PrD),又称为可传播性海绵状脑病(Transmissible Spongiform Encephalopathy,TSE),是一种侵袭人类及其他哺乳动物中枢神经系统(Central Nervous System,CNS)的传染性、神经退行性疾病,具有潜伏期长和100%致死率的特点。目前人类朊病毒病主要分为:克-雅病(Creutzefeldt-Jakob Disease,CJD)、库鲁病(Kuru)、吉斯特曼-施特劳斯综合症(Gerstmann-Straüssler-Scheinker syndrome,GSS)和致死性家族型失眠症(Fatal Familial Insomnia,FFI),以CJD最为常见。CJD又可分为散发型(sCJD)、医源型(iCJD)、家族或遗传型(fCJD or gCJD)及变异型克-雅病(vCJD)。目前临床检测方法有对患者脑组织进行活检,通过检测血液中PRNP基因突变情况判断遗传型克-雅病,以及检测sCJD患者脑脊液中14-3-3蛋白含量的升高来辅助疾病的诊断。脑组织活检对病人身体损伤极大,根据血液中PRNP基因是否突变只可判断遗传型克-雅病,存在很大局限性,而脑脊液中14-3-3蛋白的检测则特异性不强。因此,临床急需有效的朊病毒病诊断方法。微管由微管蛋白和微管相关蛋白(tau蛋白)组成,其中tau蛋白是含量最高的微管相关蛋白,微管系统是神经细胞骨架成分,可参与多种细胞功能。研究证明,tau蛋白与多种神经性疾病存在紧密联系,并在朊病毒病患者及啮齿动物模型脑组织中明显升高,其中含外显子2(tau-exon 2)和外显子10(tau-exon 10)的特异型tau蛋白占总tau蛋白含量的大部分,因此本研究建立tau蛋白ELISA方法并应用于不同类型的朊病毒病患者脑脊液中。在本研究中,用含有pGEX-2T-E2和pGEX-2T-E10质粒的原核菌体表达出目的蛋白GST tau-exon 2/10,测定目的蛋白浓度,GST tau-exon 2蛋白浓度为0.166μg/uL,GST tau-exon 10蛋白浓度为0.473μg/μL,制备单克隆抗体。制备完成的GST tau-exon 2蛋白单克隆抗体编号为1-4(1.8 mg/mL),4-1(1.7 mg/mL),GST tau-exon 10蛋白单克隆抗体编号为6-4(2.6 mg/mL),5-6(1.8 mg/mL)。用已制备的小鼠单克隆抗体使用蛋白免疫印迹方法分别检测GST tau-exon 2/10蛋白,证明所制备抗体特异性,使用蛋白免疫印迹方法在神经细胞模型和小鼠脑组织分别检测tau蛋白证明抗体敏感性。使用已制备的抗体建立更强敏感性的双抗夹心ELISA方法,最终GST tau-exon 2/10蛋白特异性单克隆抗体双抗夹心ELISA方法的条件确定如下:包被抗体H-150浓度为8μg/ml,检测抗体GST tau-exon 2(1-4)蛋白鼠源单克隆抗体、GST tau-exon 2(4-1)蛋白鼠源单克隆抗体、GST tau-exon 10(6-4)蛋白鼠源单克隆抗体、GST tau-exon 10(5-6)蛋白鼠源单克隆抗体的工作浓度分别选定为1μg/mL,1μg/mL,0.8μg/mL,1μg/mL。辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗稀释比例为1:5,000。应用已建立好的双抗夹心ELISA法对包括sCJD、GSS、FFI、T188K位点突变的gCJD及非CJD患者脑脊液中tau-exon 2/10蛋白含量进行检测,结果显示sCJD患者脑脊液中含外显子2的tau蛋白相比于非CJD患者明显升高,具有极显著统计学差异(p0.001),sCJD患者脑脊液中含外显子10的tau蛋白相比于非CJD患者明显升高,具有显著统计学差异(p0.01)。T188K位点突变的gCJD患者脑脊液中tau-exon 2/10蛋白含量相对于非CJD患者明显增高,具有显著统计学差异(p0.01)。而GSS和FFI患者脑脊液中tau-exon 2/10蛋白含量相对于非CJD患者无明显差异,无统计学差异(NS)。本研究建立的特异性tau蛋白双抗夹心ELISA方法可以有效的检测出不同类型朊病毒患者脑脊液中tau-exon 2/10蛋白含量的水平变化,为朊病毒病的检测提供有效的检验方法并对朊病毒病的机制研究提供理论依据。
【学位单位】：黑龙江八一农垦大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R742.9
【部分图文】：

为变异型 CJD（new variant CJD，简称为 vCJD）。所爆发的疯牛了世界范围内极大的社会恐慌并对全球造成了巨大的经济损失，并公共卫生问题，这使得对朊病毒的研究不仅具有重大的科学意义价值。止，还没有有效治愈朊病毒病的方法[16]。对于一般疾病来说，早大大提高治愈的几率[17]。然而朊病毒病的诊断只有根据临床体征准[18]，这通常在朊病毒病发病后期，此时患者脑组织已造成不可对中枢神经系统（CNS）发生侵袭，分布在神经细胞的表面上, PrPC）极易与其发生接触并且产生相互作用，这会使得正常细胞变化[20]，该反应使神经中朊病毒的复制加快，同时在神经细胞中极易使得细胞发生损伤及凋亡，并且最终导致了神经元丢失、脑性、胶质细胞增生、病毒样朊蛋白沉积的四种典型神经病理变化[21

毒（scrapie fibre-like prion, PrPSc）作为所有朊病毒病的病原，自从 20代发现此种病毒以来，其与众不同的复制方式及生理学特性使科学家始终占据着生命科学理论研究的焦点，并且分别有两位研究朊病毒的0 年代和 90 年代获得了至高无上的荣誉——诺贝尔生理学和医学奖。病毒皆不相同，它做为一种不包含核酸但是却可以发挥自我复制的功感染性和极高致死率的蛋白粒子—朊病毒（PrPSc）[12]，此前的研究发是由于在正常细胞里的朊蛋白（PrPC）和具有感染性的蛋白粒子（PrP用，使得正常朊蛋白结构或蛋白空间构象发生变化而来[22]，换句话说和朊病毒同样的一级结构，即相同的氨基酸序列，正常朊蛋白与朊病为在 PrPC的二级结构里面包括更多的α螺旋，而 PrPSc则包括大量的β折白空间结构发生变化随之蛋白的物理化学特性和分子的生物学特性也由在去污剂中可溶变成在去污剂中不可溶，由不可抵抗蛋白酶的消化的消化产生抵抗[25, 26]。

小大约为 35KDa，在朊蛋白的内部可以分为不同的结构区域，其中包含一个 N-端信结构区域、五个大量富含脯氨酸-甘氨酸的八肽重复序列区域、一个高度保守的中间区和一个与 GPI 锚相关的 C-端疏水区[28]。在一般情况下，PrPC由粗面内质网首先合，之后通过高尔基小体，最后定位在细胞膜的表面上[29]。因为 PrP 包含有两个不同的化位点，所有在哺乳动物的细胞中，PrP 蛋白共包括三种不同的存在形式——无糖基型、单糖基化型或者双糖基化型。细胞中的朊蛋白都是经由 PRNP 基因所进行编码PRNP 基因是 PRN 基因家族中的一员[30]。该基因家族中还包括有编码 doppel 蛋白的ND 基因和编码 shadoo 蛋白的 SPRN 基因[31, 32]。尽管 PRNP 基因由 2 到 3 个外显子组但所有物种的 PRNP 基因开放阅读框均由一个外显子进行编码[33]。如果向受体颅中种来源于其他种属的朊病毒，因为受体的内源性 PrPC基因序列较之外源宿主不同的Sc序列，朊病毒病的潜伏期在被接种受体中会明显增加，并且在这些受体中一般情况不会如期地表现出朊病毒病的四种临床病理特征。此种现象学术上称为朊病毒进行感种属屏障。
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本文编号：2844964