致脑膜炎大肠杆菌感染脑微血管内皮细胞的蛋白质组学研究

发布时间：2020-10-20 00:38

　　 肠外致病性大肠杆菌(Extraintestinal pathogenic coli,ExPEC)是近年来学术界和临床上广泛报道和关注的一类人兽共患性大肠杆菌,该菌可广泛定殖于多种宿主的肠道外组织并引发严重的感染发病。其中,由该菌感染导致的细菌性脑膜炎一直以来对于人类健康和畜禽养殖业的健康发展都是一个巨大的挑战。ExPEC侵入宿主的血脑屏障(Blood-brain barrier,BBB)是其引发脑膜炎发生发展的关键步骤,需要特定的信号分子参与其中。以往的研究表明,ExPEC的多种菌体组分在细菌侵入宿主细胞进而穿过BBB的过程中以及在对抗机体免疫清除上发挥了重要作用。除了 ExPEC本身毒力因子的参与外,研究还报道宿主细胞的一些蛋白也参与到ExPEC的感染及其侵入BBB的过程,但其参与感染与致病的具体机制仍不十分清楚。在此,我们采用同位素标记相对和绝对定量技术(Isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)并结合LC-MS/MS,鉴定并分析猪源致脑膜炎E.coli菌株PCN033、人源致脑膜炎E coli菌株RS218以及非致脑膜炎E.coli菌株HB101分别感染脑微血管内皮细胞(Brain microvascular endothelial cells,BMECs)时的差异表达蛋白,并通过差异表达蛋白的比较分析和进一步功能验证,挖掘ExPEC感染过程中的重要宿主靶点,探讨ExPEC感染导致脑膜炎的分子机制。本研究中,我们共鉴定到近3000种不同蛋白,比较不同感染组中的差异蛋白发现猪源ExPEC菌株PCN033感染细胞后出现的差异蛋白数量最多,有78种;人源致脑膜炎菌株RS218感染组出现差异蛋白43种;而非致脑膜炎层coli菌株HB101感染组最少,只有6种。分析发现,仅在两株强毒株感染后共同显著变化的蛋白共12个,分别为TEL02、IFT74、CBWD6、TBPL1、RBM5、KRT9、HIST1H1C、HIST1H1D、HIST1H1B、HIST1H1E、MIF 和 DMD。提示,这些蛋白可能参与致脑膜炎E coli的感染与入侵过程。进一步的研究发现,MIF是唯一在两株致脑膜炎,E.coli感染条件下均发生显著上调的蛋白,它能促进脑膜炎E.coli感染BMECs中细胞因子的产生,参与了脑膜炎E.coli感染BMECs中BBB的破坏。通过IPA网络分析,我们还发现NF-κB信号通路和MAPK信号通路均参与了细胞应对致脑膜炎强毒株的感染,两者共同介导了 ExPEC感染导致的炎症反应。这些差异蛋白的鉴定和信号通路的解析为我们进一步了解致脑膜炎E.coli感染入侵宿主中枢神经系统(Central nervous system,CNS)的过程和机制奠定了基础。
【学位单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R742.9
【部分图文】：

图１－１血脑屏障示意图（Ｋｉｍ?２００８）??Ｆｉｇｕｒｅ?Ｍ?Ｔｈｅ?ｂｌｏｏｄ—ｂｒａｉｎ?ｂａｒｒｉｅｒ??

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相对或绝对定量的分析技术。ｉＴＲＡＱ试剂分为４标和８标试剂，本研宄采用的??是８标ｍｉＡＱ试剂，能对８种样品进行标记，然后对混合标记后的蛋白样品通??过一级质谱、二级质谱串联质谱方法进行分析（如图１－３）。ｉＴＲＡＱ试剂包括??三个基团：一端是报告基团（ＲｅｐｏｒｔＧｒｏｕｐ），其质量从１１３－１２１?（１２０除外，因为??１２０和苯丙氨酸的亚胺离子质量一样）；另外一端是反应基团（Ｐｅｐｔｉｄｅ?Ｒｅａｃｔｉｖｅ??Ｇｒｏｕｐ），将报告基团与肽Ｎ端及赖氨酸侧链连接；中间是平衡基团（Ｂａｌａｎｃｅ??Ｇｒｏｕｐ），起平衡报告基团质量差的作用（王国佐ｅｔａｌ?２０１７）。??标记??消化；龜■?Ｚ混合二＾丨－级质请??提取僅白?｜??二级质ｉ着??４??．．．ＢＳＩ?Ｂ３?Ｄ?Ｋ２Ｓ?Ｂｌ?Ｂ９??ｍ?＊？？??，？?ｗ局部放大??｜?ｌ?—匕息?＾?ｌ－．?ｉｌ?Ｍ?－?？?Ｋ?—＾ｉｌｌ?ｔｌＬｌｌ．ｌ－ｉｌ．ｆＴｉ．ｉｌ?ｉｔｔｉ．－?７??图１－３：?ｉＴＲＡＱ实验流程??Ｆｉｇｕｒｅ?１?－３?Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ?ｐｒｏｃｅｓｓ?ｏｆ?ｉＴＲＡＱ??鉴于ｉＴＲＡＱ比以前的方法更可靠更准确，己经被广泛用于各类生物学研宄??中。近些年来
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本文编号：2847939