“分子海绵”长链非编码RNA XIST通过i调控胶质瘤成瘤及血管新生的机制研究

发布时间：2020-10-20 12:25

　　 背景及目的:人脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性恶性肿瘤,患者5年生存率不足5%。目前脑胶质瘤的发病机制尚不清楚,大量研究表明,血管化是实体肿瘤发展进程中的重要组成部分,肿瘤的新生血管能够提供肿瘤生长所需要的氧气和营养,同时清除代谢废物,促进肿瘤细胞远端转移。随着对非编码RNA研究的不断深入,越来越多的研究表明,lncRNA在肿瘤血管新生中发挥着重要作用。lncRNA XIST是在X染色体失活中起重要作用的非编码RNA,本课题组使用生物信息学方法预测发现miR-429与XIST存在互补序列,可能是XIST的靶向miRNA。因此,本研究旨在通过一系列分子生物学及细胞功能实验检测XIST、miR-429在人脑胶质瘤中的表达方式,证明XIST与miR-429的相互作用关系,探索XIST参与胶质瘤成瘤及血管新生的分子机制,为抗血管再生疗法治疗脑胶质瘤提供理论支持。方法:首先,通过分析GEO、CGGA公共数据集中胶质瘤基因表达谱,探索XIST在不同级别脑胶质瘤中的表达情况。通过荧光定量PCR技术,检测XIST在U251、A172胶质瘤细胞及HA1800正常胶质细胞中表达情况,证实XIST在胶质瘤中的作用。其次,构建慢病毒载体,在U251、A172细胞中沉默XIST的表达后,分别采用MTT分析、克隆形成、流式细胞术、Transwell以及HBMVEC细胞成管等一系列细胞功能学实验,以及分子生物学实验检测XIST对胶质瘤诱导的人脑微血管内皮细胞HBMVEC增殖、迁移和血管形成能力的影响。通过裸鼠皮下移植瘤实验验证XIST对胶质瘤成瘤的影响,并对肿瘤进行免疫组化分析,进一步证明下调XIST的表达对胶质瘤血管新生的抑制作用。再次,合成miR-429的mimic、inhibitor、mimic negative control和inhibitor negative control,转染胶质瘤细胞后检测miR-429对XIST分子表达的影响。然后通过双荧光素酶报告系统鉴定miR-429对XIST的靶向作用。最后,将miR-429inhibitor转染到沉默XIST的胶质瘤稳定转染细胞系中,采用MTT分析、克隆形成、流式细胞术、Transwell以及HBMVEC细胞成管等一系列实验检测XIST对胶质瘤诱导的人脑微血管内皮细胞HBMVEC增殖、迁移和血管形成能力的作用是否由miR-429介导。结果:基因芯片数据集GSE2223、GSE4290分析结果表明,XIST在胶质瘤组织中的表达显著高于正常脑组织,这种异常表达主要体现在高级别胶质瘤中,而低级别胶质瘤组织与正常脑组织相比差异无统计学意义,暗示XIST的表达与胶质瘤的级别无明显相关性。而CGGA数据集分析结果表明XIST的表达在原发和复发胶质瘤组织中明显不同,XIST在复发的胶质瘤组织中超表达。成功建立胶质瘤XIST基因沉默细胞系后,MTT分析、克隆形成实验、流式细胞术,证明了XIST对胶质瘤细胞增殖、克隆形成的促进作用,Transwell以及HBMVEC细胞成管实验证明了XIST对胶质瘤细胞诱导的HBMVEC迁移和成管的促进作用,提示XIST能够促进胶质瘤细胞的增殖及血管新生。其次裸鼠皮下移植瘤实验验证了XIST对胶质瘤成瘤的促进作用,瘤体免疫组化分析进一步证明了XIST分子对胶质瘤血管新生的促进作用。荧光定量PCR结果显示A172、U251胶质瘤细胞中miR-429的表达显著低于正常胶质细胞,检测沉默XIST的胶质瘤细胞中miR-429的表达水平后发现,与对照组相比沉默XIST能够显著增加细胞中miR-429的量。另外,细胞瞬转miR-429mimic能够显著降低XIST的表达量,而miR-429 inhibitor能够显著增加XIST的表达量,证明lncRNA XIST与miR-429在胶质瘤中的表达成负相关。通过生物信息学软件预测了两者之间的靶序列,并构建包含靶序列的野生型pmir GLO-WT-Luc载体以及突变型载体pmir GLO-MUT-Luc,通过双荧光素酶报告基因系统检测lncRNA XIST与miR-429的靶向关系。miR-429 mimic、pmir GLO-WT共转染能够显著降低细胞内的荧光素酶活性,且各对照组细胞内的荧光素酶活性没有明显变化,证明lncRNA XIST直接通过73045083-73045062序列靶向miR-429而实现对miR-429的调控作用。将miR-429inhibitor转染到沉默XIST的稳定转染A172sh-XIST、U251 sh-XIST细胞系中,发现miR-429 inhibitor上调了A172 sh-XIST、U251sh-XIST细胞中被沉默的XIST分子水平,并且在一定程度上恢复了两个稳转细胞增殖、克隆形成以及血管新生能力。结论:lncRNA XIST在胶质瘤细胞系及组织中高表达,且在复发的胶质瘤组织中超表达,提示基于XIST的治疗方案可能对复发胶质瘤更有效。沉默XIST能够显著抑制胶质瘤成瘤及血管新生,表明XIST在胶质瘤的发生发展过程中发挥重要作用。XIST能够靶向抑制miR-429水平,是miR-429的“分子海绵”。胶质瘤中XIST高表达抑制miR-429分子水平,进而诱导人脑微血管内皮细胞HBMVEC增殖、迁移和血管形成能力。
【学位单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R739.4
【部分图文】：

lncRNA的分类及结构

10图 1.2 lncRNA 在胶质瘤中的调控作用Fig 1.2 Functional roles of lncRNAs in glioma1.1.4 lncRNA 在胶质瘤中的临床转化前景（1）lncRNA 与胶质瘤的诊断和预后lncRNA 在正常组织与肿瘤组织之间、不同级别的肿瘤之间表达均有所差异，这

吉 林 大 学 博 士 学 位 论 文接着，我们对 CGGA 公共数据集 CGGA1 及 CGGA2 进行分析。将 CGGA01 例样本去除无意义数据后按照 WHO 标准分为病理 II 期（包括 A，O，OI 期（包括 AA，AO，AOA，）及病理 IV 期（GBM），各分期相对应的复发组 r（recurrence）表示。如图 2.2A 所示，lncRNA XIST 在复发的胶质瘤组织中著高于原发胶质瘤组织（P<0.05）。而对 CGGA2 数据集的分析结果表明 X组和复发组之间的表达存在着明显差异（P<0.05）。
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