脱氧胆酸对神经母瘤细胞SHSY-5Y的抑制作用及机理研究

发布时间：2020-10-21 02:12

　　 神经母细胞瘤是常见于儿童的颅外肿瘤,是一种恶性程度和死亡率都较高的肿瘤,儿童发病率为10.5/10万,在儿童所有肿瘤中的比例约为6-10%,却占有约15%的儿童肿瘤死亡率。目前只要采用手术的方法来治疗神经母细胞瘤,并辅以化疗、放疗等方式进行治疗。寻找新型有效毒副作用较小的化疗药物具有重要的意义。脱氧胆酸是一种次级胆汁酸,由胆酸在C-7位置上的一个羟基脱去氧生成,已有研究表明其对一些肿瘤具有抑制的作用。本论文将研究其对于神经母细胞瘤的作用,以SHSY-5Y作为体外模型,在体外探究脱氧胆酸对其作用后所引起的细胞形态变化及其作用机理的研究。采用体外细胞培养的方法,用不同浓度的脱氧胆酸(DCA)处理SHSY-5Y细胞,用MTT法检测细胞存活率;通过AO/EB、Hoechst染色用荧光显微镜进行形态学观察;划痕实验探究DCA对细胞迁移的影响;通过不同荧光染色的流式细胞术来检测DCA作用后细胞周期的分布、活性氧含量和以及细胞凋亡率;通过Western Blot和RT-PCR检测DCA处理后相关蛋白和基因的表达变化情况探讨DCA作用的分子机制。结果表明,DCA作用能够抑制SHSY-5Y细胞株的增殖,可以促进细胞乳酸脱氢酶的释放,可以使细胞形成克隆能力下降。通过形态学观察,发现细胞呈现出细胞变圆皱缩、细胞核染色质浓缩、细胞核碎裂形成凋亡小体等凋亡特征性的形态学现象。划痕实验表明,DCA作用下,细胞迁移能力降低。流式细胞仪检测细胞周期分布、细胞凋亡率、活性氧含量结果显示,经DCA诱导处理48h后,细胞周期在G2/M期所占比例显著增多,细胞凋亡率明显增大,细胞内活性氧增加,均表现为浓度依赖性。0.8 mmol/LDCA处理48 h后SHSY-5Y处于G2/M期细胞由10.0%提升到41.5%,细胞凋亡率由1.46%提升至 51.81%。Western blot 和 RT-PCR 结果显示,在 DCA 作用下,p21、p53、Bax等相关抑癌基因表达水平上调,Bcl-2、Akt等相关致癌基因表达水平下调,CDK1、CylinB1等周期蛋白表达量下降。从而我们可以得出基本结论,DCA作用下,通过影响p21、p53、CDK1、CylinB1等相关因子的表达,可以将细胞周期阻滞在G2/M期;通过影响Bcl-2、Bax、Akt等蛋白的表达量进而导致线粒体膜电位下降,膜通透性增加,进而释放Cytc到胞浆,与胞浆内Apaf1结合,各因子之间级联反应放大凋亡效应,下游凋亡执行者Caspase被激活,引起SHSY-5Y细胞凋亡。综上所述,DCA可以显著抑制神经母瘤细胞SHSY-5Y增殖,并呈浓度依赖关系;DCA处理后,使细胞周期被阻滞在G2/M期,并经线粒体途径诱导细胞凋亡。
【学位单位】：厦门大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R739.4
【部分图文】：

实验结果表明，ＤＣＡ在０．２？１．０?ｍｍｏｌ／Ｌ浓度范围内对ＳＨＳＹ－５Ｙ细胞的增殖产??生抑制作用，抑制增殖效果随着ＤＣＡ作用浓度的增加和ＤＣＡ作用时间的增加??而增强，呈现一定的浓度依赖性。结果见图２所示。??１２〇ｉ?？?２４ｈ??＾?１〇〇ｎｉ?４８ｈ??＾?８０－?＼??｜?６。－??ｒ°－??°２〇－?，??０．０?０．２?０．４?０．６?０．８?１．０?１．２??Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ?ｏｆ?ＤＣＡ（ｍＭ）??图２?ＤＣＡ对ＳＨＳＹ－５Ｙ细胞的体外增殖的影响??Ｆｉｇ．?２?Ｅｆｆｅｃｔ?ｏｆ?ｃｅｌｌ?ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ?ｂｙ?ＤＣＡ?ｉｎ?ＳＨＳＹ－５Ｙ?ｃｅｌｌｓ??４．２?ＤＣＡ对ＳＨＳＹ－５Ｙ细胞集落形成能力的影响??集落形成实验可以探宄肿瘤细胞在药物作用下对形成克隆能力影响的方法。??用６０?ｍｍ培养皿接种细胞，每皿细胞约５００个，细胞贴壁后加ＤＣＡ处理２４?ｈ后??撤去ＤＣＡ，加入新鲜的培养液，继续培养至细胞形成肉眼可见克隆，最后通过??吉姆萨染色观察拍照。实验得出，ＳＨＳＹ－５Ｙ细胞对照组所形成的克隆多并且比??较大，随着ＤＣＡ作用浓度的增加，克隆数目和大小都减小。通过计数统计出不??同浓度的ＤＣＡ作用下集落形成能力的变化如图所示。可以看出，在默认对照

随着ＤＣＡ作用浓度的增加，ＬＤＨ活性逐渐增加，在０．６?ｍｍｏｌ／Ｌ的时候有一个??突增，为５９．２％，之后趋近与一个基本稳定的值。说明，在较高浓度ＤＣＡ的作??用下，会使细胞膜破裂导致细胞内的ＬＤＨ释放到细胞外。结果见图４所示。??８０－１??一?—２４ｈ??工?６０－?????〇?４０－?／??＜Ｕ?／??２０－?／??益????０?￣ｙ??，?！?！?！?（??０．０?０．２?０．４?０．６?０．８?１．０?１．２??Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ?ｏｆ?ＤＣＡ（ｍＭ）??图４?ＤＣＡ对ＳＨＳＹ－５Ｙ细胞中ＬＤＨ释放的影响??Ｆｉｇ．４?Ｅｆｆｅｃｔ?ｏｆ?ＤＣＡ?ｏｎ?ｔｈｅ?ｒｅｌｅａｓｅ?ｏｆ?ＬＤＨ?ｉｎ?ＳＨＳＹ－５Ｙ?ｃｅｌｌｓ??４．４?ＤＣＡ作用对ＳＨＳＹ－５Ｙ细胞形态的影响??４．４．１倒置相差显微镜下观察ＤＣＡ作用后细胞形态学变化??ＳＨＳＹ－５Ｙ细胞在ＤＣＡ作用４８?ｈ后，吉姆萨染色，倒置相差显微镜下观察??并拍照，实验结果如图５所示。正常的ＳＨＳＹ－５Ｙ细胞呈梭形或者不规则多边形，??细胞形态饱满，分布均匀（图５?Ａ）；将不同浓度ＤＣＡ作用ＳＨＳＹ－５Ｙ细胞４８?ｈ??后，随着ＤＣＡ浓度的增加，细胞形态变得不规则，贴壁细胞数量逐渐减少，一??部分细胞生长成梭形，而部分细胞变圆（图５Ｄ），细胞数量和对照组细胞数量明??显减少

而ＰＣＮＡ主要的功能是参与了?Ｓ期的ＤＮＡ复制。这说明，在ＤＣＡ??的作用下，ＤＮＡ的复制可能并没有受到直接的影响，Ｓ期正常进行。这与我们流??式细胞术检测的结果一致。结果见图１０所示。??０?０．２?０．４?０．６?ｍｍｏｌ／Ｌ??ｐＣＮＡ?ｍｍｍｍ?＿?丨丨＿丨??（３－ａｃｔｉｎ??ｐｅｃｔｉｎ?ＰＣＮＡ??１．５－１?１．５－１??［〇—?隊翁．．．＂?１?°?．．．?＇！??Ｉ?＾?＾?Ｍ?Ｉ?條溆呤、?嘴??０５?ｍ?ｍ?ｍ?ｍ?°５?＿?麟?＿?…??ｒｏｌｌ?；?Ｉ?Ｉ?Ｉ?ｌ?ｌ?Ｉ?－?００ｌｋｙｄ?ｍｍ?Ｉ?ｖ：－ｍ．??＾?＾?。?＾?＾?＾??Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ?ｏｆ?ＤＣＡ（ｍＭ）?Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ?ｏｆ?ＤＣＡ（ｍＶＩ）??图１０?ＤＣＡ对ＳＨＳＹ－５Ｙ细胞ＰＣＮＡ蛋白表达的影响??Ｆｉｇ．?１０?Ｅｆｆｅｃｔ?ｏｆ?ＤＣＡ?ｏｎ?ｔｈｅ?ｐｒｏｔｅｉｎ?ｌｅｖｅｌ?ｏｆ?ＰＣＮＡ．??４２??
【参考文献】

相关期刊论文 前4条

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本文编号：2849482