LncRNA-LYPLAL1-2调控人脑胶质瘤的生物学功能及其分子机制研究

发布时间：2020-10-22 16:40

　　 起源于人类神经胶质细胞的恶性肿瘤叫做神经胶质细胞瘤,简称胶质瘤,是人类神经系统恶性程度较高的疾病之一,在中枢神经系统肿瘤中约占80%以上。根据国家癌症中心2017年发布的数据显示,我国神经系统每年新发肿瘤病人为95,900人,死亡病人达55,100人。由于胶质瘤具有高度的增殖能力、侵袭性等特点,目前标准治疗方案(即开颅手术切除联合放射治疗和化学药物治疗)仍难以达到治愈效果,因此进一步揭示胶质瘤的发病机制,寻找并探求治疗胶质瘤的有效靶点是当下亟待解决的难题。众所周知,胶质瘤的发生发展是受多基因、多因素共同调控的,相关因子的异常表达都有可能引起胶质瘤细胞功能性的改变,进而参与胶质瘤发生发展全过程。本研究以寻找影响胶质瘤发生发展的蛋白或基因为出发点,深入探讨其对胶质瘤细胞功能的调控及调控的具体分子机制。本研究旨在探明中长链非编码RNA LYPLAL1-2(Long non coding RNA lysophospholipase-like l-2,LncRNA-LYPLALl-2,LYPLAL 1-2)在大脑胶质瘤中的表达量及其在胶质瘤发生发展过程中扮演的角色,从而为治疗胶质瘤提供有效的治疗新思路。本研究首先通过美国国立生物技术信息中心(NCBI)创建并维护的基因表达数据库(GEO数据库),进行生物信息学分析并结合相关文献,分析得出具有表达差异较显著的LYPLAL 1-2,非编码小分子RNA-217-5p(miR-217-5p)和趋化因子受体7(CCR7)之间的关系,即LncRNA LYPLAL l-2通过miR-217-5p调控CCR7的表达,进而抑制脑胶质瘤的发生发展。同时收集55例通过病理确诊的大脑胶质瘤病人的肿瘤组织和瘤周组织,提取RNA进行qRT-PCR(逆转录定量PCR),检测结果显示,胶质瘤细胞中LYPLAL1-2的表达量明显降低。对胶质瘤不同级别之间LYPLAL1-2的表达进行分析,级别越高,LYPLAL1-2的表达量显著下降。同时通过体外细胞实验发现,LYPLAL1-2过表达能显著抑制胶质瘤细胞的迁移和侵袭能力。进一步通过在体实验证实,裸鼠采用皮下注射成瘤方法注射OEC(慢病毒载体构建的U87空白对照组)或OE-LYPLAL1-2(慢病毒载体构建的U87过表达LYPLAL1-2组),取肿瘤组织进行大小检测,发现LYPLAL1-2过表达能显著抑制胶质瘤生长。最后,双荧光素酶报告基因实验和Western blot等实验并结合生物信息学分析结果,发现在胶质瘤细胞中,LYPLAL1-2靶向负调控miR-217-5p,进而调控CCR7表达。由此,得出结论LYPLAL 1-2通过负调控miR-217-5p使CCR7表达减少,进而抑制恶性神经胶质瘤发生发展。此外,本研究还证实TGF-β1(transforming growth factor-(3,转化生长因子-β1)对胶质瘤细胞侵袭的促进作用,并以CCR7为中心,深入阐明CCR7调控TGF-β1介导的胶质瘤细胞功能的具体分子机制。此部分研究利用神经胶质瘤细胞细胞株(U251和U87,人神经胶质细胞瘤细胞和人脑星形胶质母细胞瘤细胞),将其分别培养于基础培养基和含TGF-βl的培养基中6 h,12 h,24 h,再采用免疫印迹实验检测上皮相关标志物E钙黏蛋白(E-cadherin),间质相关标志物N钙黏蛋白(N-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)的表达。E钙黏蛋白,N钙黏蛋白和波形蛋白是可以衡量肿瘤细胞上皮细胞-间充质转化(eβithelial-mesenchymal transition EMT)水平的蛋白。当上皮细胞-间充质转化(EMT)发生时,N-cadherin和波形蛋白(Vimentin)表达上调,而E-cadherin蛋白表达下调。实验结果显示,TGF-βl可使U251细胞和U87细胞的E-cadherin表达降低,N-cadherin和Vimentin的表达上升,从而促进胶质瘤细胞的EMT的发生。Transwell迁移和侵袭实验中观察到TGF-β1能明显加快细胞的迁移和侵袭速度。将U251和U87细胞分别用TGF-β1处理,通过转染小干扰RNA(CCR7 siRNA,抑制CCR7表达)和CCR7中和抗体(Ab CCR7,中和CCR7蛋白,降低CCR7蛋白水平)处理,分组为对照(Con)组,TGF-β1组,si CCR7+TGF-βl组,Ab CCR7+TGF-β1组。免疫印迹法结果显示,TGF-β1处理的胶质瘤细胞中CCR7的表达相较未处理组明显上升。而CCR7干扰的细胞即使给予TGF-ββl处理(即si CCR7+TGF-βl组)相比只给予TGF-β1处理,E-cadherin的表达呈增加趋势,而N-cadherin和Vimentin的表达下降,即表明抑制了EMT。将以上分组进行细胞增殖,迁移和侵袭实验,观察到TGF-β1能促进细胞增殖,迁移和侵袭作用,也会因CCR7的表达降低而减慢。另外,细胞周期实验结果发现,CCR7影响TGF-β1介导的胶质瘤细胞的细胞周期进程。TGF-ββ1使胶质瘤细胞周期的阻滞效应减弱。而抑制CCR7表达可逆转TGF-β1对胶质瘤细胞周期阻滞的减弱效应。Western blot实验结果则显示TGF-β1使胶质瘤细胞中MMP2/9(matrix metalloβroteinase基质金属蛋白2/9)的表达增加,而干扰CCR7减弱TGF-β1对MMP2/9表达的促进作用。MMP2/9活性的改变与MMP2/9表达水平的改变一致,即TGF-β1处理后MMP2/9的活性增强,当CCR7低表达时,TGF-β1对MMP2/9活性的增强作用减弱。由此证明,TGF-β1通过上调CCR7的表达增强MMP2/9的活性,促进胶质瘤细胞的增殖,迁移和侵袭。此外,本研究的酶联免疫吸附试验结果显示,TGF-β1 处理后NF-KB p65(Nuclear factor KB p65,核因子-KB p65)的表达明显增加,且干扰CCiR7后,会降低此效应。进一步通过qRT-PCR(实时荧光定量PCR)和双荧光素酶报告基因实验证实,NF-κ B p65的转录受MMP2/9(顺式作用元件)调控。综合以上数据,得出结论TGF-β1通过调控CCR7进而激活MMP2/9,而MMP2/9作为顺式作用元件调控NF-κ B p65进而促进胶质瘤细胞的增殖,迁移和侵袭。综上所述,本项目得出结论,LYPLAL 1-2通过调控miR-217-5p/CCR7抑制恶性神经胶质瘤,而CCR7可通过MMP2/9和NF-κB通路调控TGF-ββl介导的恶性神经胶质瘤生物学功能。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R739.41
【部分图文】：

例）和ｍｉＲＮＡ的测序数据（包括ｎｏｒｍａｌ样本５例，ＬＧＧ样本５２５例）进行分??析。另外，应用ｈ＿ｍｉｍａ＿８ｘｌ５ｋ实验方法，对ｎｏｒｍａｌ样本１０例，ＧＢＭ样本５６３??例的ｍｉＲＮＡ的芯片数据进行分析。??将数据经过标准化后处理后，并根据设定的阈值条件（ｐ＜〇．〇５，?｜ｌ〇ｇＦＣ｜＞ｌ），??获得差异表达ｍＲＮＡ的热图和火山图，获得差异ｍｉＲＮＡ的火山图，见图１和２。??一？?—

?山东大学博士学位论文???３．２?ＣＣＲ７基因的ＫＥＧＧ分析??基于测序数据的ＣＣＲ７的表达值，并结合文献报道ＣＣＲ７在肿瘤细胞ＥＭＴ??形成及肿瘤转移中的作用，本研究将关注点集中在ＣＣＲ７上。对ＣＣＲ７的表达值??做ＧＳＥＡ分析，旨在获得ＣＣＲ７的正向相关基因和负向相关基因，以及ＣＣＲ７??可能参与调控的通路。??以ＫＥＧＧ特征基因集合作为富集背景，将ＣＣＲ７的表达值作为表型文件，分??别计算每个基因和ＣＣＲ７的Ｐｅａｒｓｏｎ相关系数；并将ＣＣＲ７与其它基因的相关系??数（不取绝对值）进行降序排序，作为扫描排序序列，进行富集分析。设阈值为??ＮＯＭ／？ｖａｌ＜０．０５，得至丨Ｊ负相关特征基因集合１个：ＴＡＳＴＥ＿ＴＲＡＮＳＤＵＣＴＩＯＮ，??正相关特征基因集合３３个。??

３．３对目的ｍｉＲＮＡ和ｍＲＮＡ的表达值进行统计分析??结合文献和差异表达分析结果，提取ｍｉＲＮＡ－２１７－５ｐ和基因ＣＣＲ７在ＴＣＧＡ??中的表达值，然后分别做ｎｏｒｍａｌ?ｖｓ．?ＬＧＧ?ｖｓ．?ＧＢＭ表达箱线图，见图４。??－?８?°??Ｏ??ｗ?＿?〇??ｏｉ??〇??８?〇??〇?ｏ?°??－＾?■?Ｏ??．１?０??１?ｓ?了??３＂—?Ｉ?丨??§?－?Ｉ?＾??＿?Ｉ??ｑ?＿?：?—■—??Ｉ?Ｉ?Ｉ??ｎｏｒｍａｌ?ＬＧＧ?ＧＢＭ??ＳＴＡＧＥ??ｌ?Ｈ?８??Ｉ?〇??ｆ?１??Ｉ－?＾?１??ｉ?＝??Ｉ?Ｉ?ｉ??ｘ?Ｑ．?００?－??Ｉ?＾－１?卜?＿??ＣＭ?－??ｍ??２?￣?〇?－?°??ｉ?ｉ??１?１???ｎｏｒｍａｌ?ＧＢＭ?ｎｏｒｍａｌ?ＬＧＧ??ＳＴＡＧＥ?ＳＴＡＧＥ??图４．不同程度的ＧＢＭ中目的ｍｉＲＮＡ和ｍＲＮＡ表达情况。上图为ＣＣＲ７的箱??线图，下图（左）为ｈｓａ－ｍｉＲ－２１７－５ｐ在ＧＢＭ－ｎｏｒｍａｌ的箱线图，下图（右）为??ｈｓａ－ｍｉＲ－２１７－５ｐ?在?ＬＧＧ－ｎｏｒｍａ丨的箱线图。??３．４?ｍｉＲＮＡ靶基因预测??利用预测工具ｍｉＲｗａｌｋ［６］，预测ＣＣＲ７的靶向ｍｉＲＮＡ和ＬＹＰＬＡＬ１－２的靶??向ｍｉＲＮＡ。鉴于存在差异的ｍｉＲＮＡ数量多，本研宄只提取了差异排名前３０的??ｍｉＲＮＡ
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本文编号：2851845