ARHGEF17变异导致颅内动脉瘤机制初探

发布时间：2020-10-28 09:09

　　 背景颅内动脉瘤(IA)通常是一种迟发性疾病,影响1-3%的普通人群,并导致危及生命的蛛网膜下腔出血(SAH)。遗传易感性与IAs有关,但致病基因仍不明确。方法和结果作者对11个家系的20例中国汉族IA患者进行了新一代测序(NGS)。利用生物信息学筛选技术寻找罕见和低频等位基因频率的候选有害变异。作者也进一步研究了多个种族样本中的候选变异,这些样本包括86个全外显子组测序,测序数据均来自于先前发表的三项研究中的家族性IA病例。在中国发现队列中,低频变异c.4394CA_p.Ala1465Asp(rs2298808)ARHGEF17明显与IA相关(P=7×10~(-4),OR=7.34),随后在日本家族性IA患者中进行了重复性研究(P=0.04,OR=4.00,95%CI=0.832-14.8)。在中国1031例散发性IA患者和599例对照个体中,上述发现也得到了证实(P=0.023,OR=1.55,95%CI=1.00-2.46)。结合来自4个不同种族(即中国人、日本人、欧洲裔美国人和法裔加拿大人)的所有家族性IA患者的测序数据,病例与对照组比较,发现ARHGEF17的突变负荷显著增加(21/106 vs 11/306,P=8.1×10~(-7),OR=6.6,95%CI=2.9-15.8)。在arhgef17敲降斑马鱼中,ARHGEF17在脑血管中高度表达。arhgef17基因敲除导致斑马鱼脑区血液外溢。内皮病变仅在arhgef17缺陷斑马鱼的脑血管上发现。作者通过慢病毒shRNA敲降HUVEC中ARHGEF17,通过RNA-seq技术,发现了190个上调,141个下调的差异基因,并且我们对这些差异基因进行了GO富集分析和KEEG富集分析,发现部分差异基因富集到了和IA相关的炎性和细胞间连接的通路。结论ARHGEF17是IA的危险基因。ARHGEF17突变可能破坏了颅内血管的炎性水平和细胞间连接进而损伤脑血管而促使IA发生和发展。当然这一假设未来还需要通过IA小鼠模型和分子生物学实验进一步验证。
【学位单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R743
【文章目录】：
中文摘要
Abstract
缩略语/符号说明
前言
    研究现状、成果
    研究目的、方法
一、高通量测序技术探寻颅内动脉瘤候选基因的研究
    1.1 对象和方法
        1.1.1 我们确定的家族性IA病例和散发性病例
        1.1.2 在既往未完全研究的家族性IA病例进行重复研究和验证
        1.1.3 发现研究阶段和重复研究阶段的对照组人群
        1.1.4 散发性IA病例中重复研究发现低频危险变异位点
        1.1.5 医学伦理学声明
        1.1.6 基因组测序和质量控制
        1.1.7 推断样本的种族
        1.1.8 IA候选变异的优先级
        1.1.9 基因水平的变异富集检验（Gene-level variant enrichment test）
        1.1.10 Identity-by-Descent（IBD）分析
        1.1.11 RNA表达分析
        1.1.12 蛋白建模
        1.1.13 WGS建库测序流程
        1.1.14 WES建库测序流程
    1.2 结果
        1.2.1 通过基因组测序确定了30 个候选基因变异位点
        1.2.2 在其他家族性动脉瘤病例中重复性研究所筛选候选变异
        1.2.3 基因水平变异富集分析发现IA病例ARHGEF17 的变异负荷明显高于对照组
        1.2.4 ARHGEF17 变异的系谱和IBD分析
        1.2.5 散发性IA的相关性分析又提供了证据支持ARHGEF17是IA的危险基因
        1.2.6 ARHGEF17 功能及其突变的功能研究
    1.3 讨论
    1.4 小结
二、斑马鱼模型验证IA候选基因ARHGEF17
    2.1 对象和方法
        2.1.1 实验器材和试剂
            主要实验仪器
            主要试剂
        2.1.2 斑马鱼的饲养条件
            2.1.2.1 斑马鱼的生存条件
            2.1.2.2 斑马鱼的饲养和繁殖
            2.1.2.3 斑马鱼的体外受精技术
            2.1.2.4 斑马鱼的安乐死
        2.1.3 斑马鱼品系
        2.1.4 斑马鱼胚胎原位杂交
        2.1.5 免疫荧光观察斑马鱼脑血管的ARHGEF17 的表达
            2.1.5.1 固定和包埋
            2.1.5.2 脱蜡
            2.1.5.3 抗原修复
            2.1.5.4 染色
        2.1.6 Morpholinos敲降斑马鱼ARHGEF
        2.1.7 mRNA挽救实验
        2.1.8 共聚焦成像分析
    2.2 结果
    2.3 讨论
    2.4 小结
三、通过RNA-Seq初探ARHGEF17 功能缺失与IA关系
    3.1 对象和方法
        3.1.1 实验器材和试剂
        3.1.2 HUVEC 的原代培养
        3.1.3 构建慢病毒质粒
            3.1.3.1 克隆构建部分
            3.1.3.2 质粒转染与慢病毒收获
            3.1.3.3 慢病毒浓缩与纯化
            3.1.3.4 慢病毒质量检测
        3.1.4 慢病毒转染HUVEC
        3.1.5 测序
            3.1.5.1 建库测序流程（图26）
            3.1.5.2 生物信息学分析流程（图27）
    3.2 结果
        3.2.1 实验组和对照组差异表达基因
        3.2.2 GO 富集分析
        3.2.3 差异基因KEGG富集分析
    3.3 讨论
        3.3.1 IA和炎症之间的关系
        3.3.2 IA和细胞间连接的关系
    3.4 小结
全文结论
论文创新点
参考文献
发表论文和参加科研情况说明
综述 颅内动脉瘤发生机制研究进展简述
    1.颅内动脉瘤相关的遗传疾病
    2.家族性颅内动脉瘤
    3.散发性颅内动脉瘤
    4.颅内动脉瘤转录组学研究
    5.颅内动脉瘤表观遗传学研究
    6.与 IA相关的血管生成因子
    7.IA和炎症之间的关系
    8.IA和细胞间连接的关系
    9.展望
    综述参考文献
致谢
个人简历

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