Dynactin在多巴胺神经元退行病变中的作用及机制研究

发布时间：2020-10-31 05:08

　　 目的:dynactin是突触-胞质逆行运输复合物成员之一,在突触到胞质的运输途径中起重要作用。正常人大脑中dynactin表达随年龄增加而增加,帕金森病患者大脑中dynactin表达却在随年龄增加而减少,提示dynactin的变化可能和帕金森病发生机制有关。为寻找帕金森病早期病变即多巴胺神经元退行性病变的原因,为帕金森病早期诊断提供依据。本实验围绕dynactin展开,研究其功能障碍是否会造成帕金森病样症状,是否会造成多巴胺神经元退行性病变,如果造成多巴胺神经元退行性病变,那么其机制有哪些,是否会造成synuclein等蛋白异常聚集及自噬体增加。如果造成,其机制是否与dynactin逆行性轴浆运输这一功能受影响有关。材料与方法:本实验研究方法分为体内与体外两部分。(1)体内实验,利用浓度梯度dynactin特异性抑制剂MB抑制Tg(Vmat2-GFP)斑马鱼dynactin表达构建斑马鱼模型,通过统计生存率;观察斑马鱼外形变化、行为学改变;使用运动速率实验、明暗室实验,并与MPTP帕金森病斑马鱼模型比较,系统评估与帕金森病样症状相识与不同。使用活细胞工作站,激光共聚焦等设备,实时观察间脑多巴胺神经元数量变化;通过整胚免疫荧光方法观察synuclein聚集情况。(2)体外实验,dynactin-siRNA敲降SH-SY5Y细胞系。荧光免疫观察细胞内synuclein表达,在SH-SY5Y细胞系中转染mTagRFP-mWasabi-LC3观察Wasabi与TagRFP表达及分布,使用WB测定LC3-II,P62表达水平判断自噬流途径。使用活细胞工作站、激光共聚焦等设备观察稳转synuclein-GFP质粒和mTagRFP-mWasabi-LC3质粒后细胞内轴突运输状态。免疫荧光双标dynactin和dynein确定逆行性轴浆运输受阻状况。结果:(1)抑制斑马鱼dynactin表达后,斑马鱼胚胎、幼鱼存活率及孵化效率下降,胚胎孵化延迟,尾部弯曲畸形,脊柱僵直,平衡失态,震颤,心包水肿。斑马鱼运动能力减弱,表现为自由运动速率和机械刺激后运动速率减慢。通过观察活体Tg(Vmat2-GFP)转基因斑马鱼间脑多巴胺神经元情况,发现降低dynactin的表达造成多巴胺神经元数量明显减少。(2)在SH-SY5Y细胞内降低dynactin表达,造成帕金森病相关基因表达变化,synuclein蛋白大量聚集且分布异常,主要在轴突和胞质近轴突端大量聚集。在dynactin-siRNA敲降组中,由LC3标记的自噬小泡在胞质近轴突端和膜周围大量聚集,这与典型的诱导自噬途径不同,自噬体并不以核周增多为主。结合WB结果证明自噬流诱导途径增加,dynactin的减少造成自噬体位置的改变,可能是造成synuclein最终聚集在上述位置的原因之一。(3)实时观察SH-SY5Y细胞,发现细胞内形成大量神经珠,且synuclein和LC3的轴浆逆行性运输发生障碍。逆行轴浆运输dynein-dynactin复合体形成减少,分布异常,由散在分布变为在胞质近轴突端和突触集中分布。dynactin减少造成逆行轴浆运输障碍,导致多巴胺神经元退行病变。结论:本实验确立mycalolide B(MB)浓度为33.4~50.3μg/L区间内建立的斑马鱼模型,在行为学与形态学上和传统MPTP建立的帕金森病动物模型相似,说明dynactin降低造成类帕金森病症状,主要表现为运动能力减弱,姿态异常等。特异敲降和抑制dynactin,斑马鱼多巴胺神经元减少,说明抑制dynactin造成多巴胺神经退行性病变。斑马鱼和SH-SY5Y细胞内synuclein大量聚集胞质近轴突端和突触与路易士小体形成部位一致,提示dynactin功能障碍产生帕金森病样病理变化。LC3近轴突端和膜周围大量聚集特点可能和synuclein在胞质近轴突端和突触聚集有关,而且与通过WB证实的自噬流诱导途径增加现象推测可能是逆行性轴浆运输障碍造成。活细胞观察细胞内物质运输,以及synuclein,LC3运输,dynein和dynactin分布异常都提示细胞内逆行性轴浆运输障碍。综上所述,dynactin减少导致逆行性轴浆运输受阻,进而造成synuclein蛋白在轴突和胞质近轴突端聚集,代谢受阻,自噬增加,最终导致多巴胺神经元退行病变。
【学位单位】：成都医学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R742.5
【文章目录】：
摘要
Abstract
前言
第一部分 降低dynactin表达在多巴胺神经元退行性变的作用
    1 引言
    2 材料与方法
        2.1 实验动物及饲养
        2.2 试剂、耗材和仪器
        2.3 主要试剂的配制
        2.4 主要实验方法
        2.5 统计学分析
    3 实验结果
        3.1 MB与MPTP致斑马鱼胚胎（幼鱼）存活率及孵化效率下降
        3.2 MB与MPTP对斑马鱼外观的影响
        3.3 MB与MPTP致斑马鱼运动能力减弱
        3.4 降低dynactin表达造成斑马鱼Vmat2阳性神经元减少
    4 讨论
    5 小结
第二部分 敲降dynactin造成synuclein聚集且诱导自噬
    1 引言
    2 材料与方法
        2.1 实验细胞培养及分组
        2.2 试剂、耗材和仪器
        2.3 主要试剂的配制
        2.4 实验方法
        2.5 统计学分析
    3 实验结果
        3.1 dynactin表达减少造成帕金森病相关基因表达异常
        3.2 敲降SH-SY5Y细胞dynactin导致synuclein聚集
        3.3 敲降dynactin造成大量自噬泡形成
        3.4 通过诱导途径使自噬体增加
    4 讨论
    5 小结
第三部分 敲降dynactin导致逆行轴浆运输受阻
    1 引言
    2 材料与方法
        2.1 实验细胞构建
        2.2 试剂、耗材和仪器
        2.3 实验方法
        2.4 统计学分析
    3 实验结果
        3.1 敲降dynactin造成逆行轴浆运输障碍
        3.2 敲降dynactin致α-synuclein轴浆逆行性运输受阻
        3.3 dynactin敲降后,dynein分布异常
    4 讨论
    5 小结
全文总结
参考文献
文献综述
    参考文献
攻读硕士学位期间研究成果
致谢

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 ;你为什么想吃肉?多巴胺神经元在“捣鬼”[J];家庭医药.快乐养生;2017年06期

2 璐璐;;总想吃肉,或是多巴胺神经元在“捣鬼”[J];老同志之友;2017年15期

3 吴晓牧;丁伟荣;王卫真;易敬林;何丹;陈元仲;;人骨髓间充质干细胞向多巴胺神经元分化的体外研究[J];临床神经病学杂志;2007年02期

4 盛锦根;徐德隆;余慧贞;唐琴敏;徐修蓉;;叔二苯哌啶拮抗MPTP对多巴胺神经元毒性作用的实验研究[J];上海医学;1987年07期

5 黄森;;中枢神经系统多巴胺神经元的发育[J];神经解剖学杂志;1989年01期

6 黄开星;金国章;;中枢多巴胺神经元放电活动的特点[J];生理科学进展;1989年02期

7 邓兴力;杨智勇;王进昆;王应莉;雷德强;王永刚;刘如恩;冯忠堂;;胚胎多巴胺神经元移植治疗帕金森病的实验研究[J];中国微侵袭神经外科杂志;2010年08期

8 谭雪锋,金国华,田美玲,秦建兵,徐慧君;人神经干细胞向多巴胺神经元的定向分化[J];交通医学;2003年05期

9 李娟;曾晓锋;杨根梦;仝品芬;代解杰;;新生树鼩多巴胺神经元的体外培养[J];中国比较医学杂志;2018年07期

10 ;氧化石墨烯可调节多巴胺神经元分化[J];分析测试学报;2014年06期

相关博士学位论文 前10条

1 郭宏;多巴胺受体激动剂与多巴胺神经元的生长和发育[D];中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）;2003年

2 程葆华;高酮饮食及D-β-羟基丁酸对帕金森病模型的作用及其机制[D];山东大学;2008年

3 俞仲望;硝基化修饰α-Synuclein诱导大鼠中脑黑质多巴胺神经元死亡[D];第二军医大学;2010年

4 胡军;α7烟碱乙酰胆碱受体的神经保护作用及其机制研究[D];南京医科大学;2012年

5 张玉梅;长期低剂量皮下注射鱼藤酮制备多巴胺神经元损伤模型及其机制研究[D];大连医科大学;2009年

6 薛伟宁;大鼠黑质致密部多巴胺神经元的膜共振现象及其机制研究[D];第四军医大学;2012年

7 魏春玲;突触后神经元兴奋性的活动依赖的长时程变化[D];陕西师范大学;2013年

8 高慧明;脑内炎症介导的帕金森病：病因和发病机制研究[D];大连医科大学;2003年

9 李超;多巴胺受体激动剂在帕金森模型中的神经保护机制研究[D];山东大学;2010年

10 郑慧芬;自噬在系统性炎症所致黑质多巴胺神经元损伤中的作用及机制研究[D];苏州大学;2013年

相关硕士学位论文 前10条

1 王玲;seipin缺失对多巴胺神经元的影响及其机制研究[D];南京医科大学;2018年

2 段凌晗;Dynactin在多巴胺神经元退行病变中的作用及机制研究[D];成都医学院;2018年

3 陈宏恩;帕金森症背景下多巴胺神经元的动态变化[D];福州大学;2015年

4 张振涛;多巴胺神经元毒素重启细胞周期作用的研究[D];华中科技大学;2007年

5 徐圆圆;6-氨基-1-氢—吲唑对帕金森病多巴胺神经元的保护作用及其机制研究[D];南方医科大学;2016年

6 黄晓丹;恐惧引起的多巴胺神经元SK通道的功能变化[D];南京师范大学;2017年

7 李佳;vPAG多巴胺神经元在丙泊酚麻醉中的作用机制研究[D];遵义医学院;2016年

8 纪国学;~（99m）Tc-TRODAT-1评价小鼠多巴胺神经元功能的实验研究[D];大连医科大学;2008年

9 曹旭;H_2O_2对多巴胺神经元选择性损伤的作用研究[D];华中科技大学;2007年

10 颜楠;G蛋白调节子Rgs5在炎症调控中作用的研究[D];南京医科大学;2013年

本文编号：2863485