舒巴坦对全脑缺血大鼠海马CAI区GLT-1结合特性、谷氨酸摄取及谷氨酸浓度的影响

发布时间：2020-11-05 11:04

　　 谷氨酸(Glu)是中枢神经系统中最广泛的神经递质,广泛参与中枢神经系统生理功能的调节。谷氨酸能神经元受到刺激去极化后将谷氨酸释放到突触间隙中,其浓度由几微摩尔瞬时升高至几毫摩尔,激活谷氨酸受体,从而发挥生理功能。在某些病理条件下,突触间隙内谷氨酸浓度异常升高,过度激活突触后膜的离子型和代谢型谷氨酸受体,引起大量Ca~(2+)及Na~+离子内流,触发并激活细胞内的信号级联反应,启动一系列病理反应过程,神经元膜结构破坏,细胞内成分的释放,局部炎性反应性水肿甚至坏死或者凋亡,引起谷氨酸的兴奋性毒性作用。由于突触间隙内没有分解谷氨酸的代谢酶,突触间隙内的谷氨酸由谷氨酸转运体从突触间隙中清除。在所有类型的谷氨酸转运蛋白中,胶质细胞谷氨酸转运体-1(glial glutamate transporter,GLT-1)清除皮质和海马中释放的大部分谷氨酸。在海马中表达的大约80%的谷氨酸转运蛋白是GLT-1。鉴于谷氨酸的兴奋性毒性作用在脑细胞缺血缺氧性损害中的重要作用,提高谷氨酸转运体清除谷氨酸的能力,即增加GLT-1的表达及功能可作为治疗脑缺血性疾病的靶点。研究发现,用β-内酰胺类抗生素,如头孢曲松钠可上调GLT-1的表达和摄取活性。我室以往研究也表明,头孢曲松钠可通过上调GLT-1的表达发挥抗全脑缺血的神经保护作用。这些研究虽然证实了头孢曲松钠的神经保护作用,但是其作为一线强效抗生素,长期大量使用会导致诸如菌群失调、细菌耐药等许多副作用,这些副作用严重限制其作为抗脑缺血性损伤药物的应用。舒巴坦(sulbactam)属于非典型β-内酰胺类抗生素,与头孢曲松钠结构相似,具有β-内酰胺环,但抗菌作用非常弱,临床上一般将其作为β-内酰胺类抗生素的增效剂,与其它β-内酰胺类抗生素合用以增强抗菌效果。鉴于舒巴坦与头孢曲松钠结构的相似性,舒巴坦有可能通过上调GLT-1的表达和功能而发挥与头孢曲松钠类似的神经保护作用;同时,考虑到舒巴坦几乎无抗菌作用,不会产生菌群失调等副作用,我室针对舒巴坦的抗脑缺血作用展开了一系列的研究,证实舒巴坦也可通过上调GLT-1的表达发挥抗缺血性脑损伤作用。但是,在这一过程中,舒巴坦对于GLT-1的功能,包括其与谷氨酸的结合特性和对谷氨酸的摄取能力是否发生变化?这些变化对脑缺血时脑细胞外液谷氨酸浓度是否产生影响等,尚未阐明。因此,本研究采用全脑缺血再灌注模型大鼠,应用放射性配基结合方法(L-~3H-glutamate标记法),观察舒巴坦对全脑缺血大鼠海马GLT-1结合特性及其对谷氨酸摄取的影响。在此基础上,应用微透析及高效液相联合质谱法,观察GLT-1的上述变化对脑组织细胞外液谷氨酸浓度的影响,为阐明GLT-1在舒巴坦发挥抗缺血性脑损伤作用提供进一步的实验依据,同时也为临床上脑缺血性疾病的防治研究提供新的线索和思路。第一部分舒巴坦对全脑缺血大鼠海马CA1区GLT-1结合特性的影响目的:观察舒巴坦在抗全脑缺血过程中,对GLT-1的结合特性,包括最大结合量和亲和力的影响,探讨舒巴坦对GLT-1功能的影响。方法:应用神经病理学评价方法,在确定舒巴坦发挥抗全脑缺血、发挥神经保护作用的基础上,应用~3H标记的谷氨酸(L-~3H-glutamate)进行放射性配基结合实验,观察确定这一过程中GLT-1的结合特性的变化。将Wistar大鼠随机分为以下7组,每组11只。6只用于GLT-1结合特性的测定,5只用于神经病理学评价。1.Sham对照组:给大鼠侧脑室注射舒巴坦的溶剂生理盐水(normal saline,NS)10μl,连续注射5 d,于末次注射后24 h行全脑缺血的sham手术。2.全脑缺血组(Brain ischemia):给大鼠侧脑室注射舒巴坦的溶剂NS 10μl,连续注射5 d,于末次注射后24 h行全脑缺血处理(8 min,以下同),之后恢复脑血液再灌流。3.舒巴坦对照组(Sulbactam control):给大鼠侧脑室注射舒巴坦溶液10μl(180 nmol,以下同),连续注射5 d,于末次注射后24 h行全脑缺血的sham手术。根据我室崔鑫等的研究,选择舒巴坦侧脑室注射的有效剂量180 nmol。4.舒巴坦预防组(Sulbactam prevention):给大鼠侧脑室注射舒巴坦溶液10μl,连续注射5 d,于末次注射后24 h行全脑缺血处理,之后恢复脑血液再灌流。5.舒巴坦预防+GLT-1 AS-ODNs组(Sulbactam prevention+AS-ODNs):在舒巴坦预防组的基础上,于第一次注射舒巴坦后36 h、72 h以及全脑缺血处理前12 h右侧脑室注射GLT-1 AS-ODNs双蒸水溶液10μl(18 nmol);其它同全脑缺血组。同时设R-ODNs对照组(Sulbactam prevention+R-ODNs),以R-ODNs(18 nmol)代替AS-ODNs,其它同舒巴坦预防组+GLT-1 AS-ODNs组。6.GLT-1 AS-ODNs对照组(AS-ODNs control):在sham组基础上,于第一次注射舒巴坦的溶剂后36 h、72 h以及全脑缺血sham手术前12 h右侧脑室注射GLT-1 AS-ODNs溶液10μl(18 nmol),其它同sham组。各组大鼠于规定时间点,即:全脑缺血后即刻、6 h、12 h、1 d、2 d、3 d取材用于GLT-1结合特性的测定,7 d取材用于脑组织病理学评价。采用放射性配基结合法测定GLT-1的结合特性,包括最大结合量(Bmax值)和亲和力(Kd值)。Bmax值越大,GLT-1的数量越多;Kd值越小,GLT-1的亲和力越高。结果:1.Bmax值的变化与sham组相比,舒巴坦对照组中各时间点Bmax值明显升高(P0.05),而在GLT-1 AS-ODNs对照组中则明显降低(P0.05)。全脑缺血组大鼠在8 min缺血打击后,与缺血后即刻时间点相比较,Bmax值呈现下降趋势,48 h-72 h下降加剧,在本实验检测时间段内于3 d(72 h)时降至最低(P0.05 vs 0 h、6 h);与sham组相比较,各个时间点的Bmax值均明显降低(P0.05)。舒巴坦预防组中,与缺血后即刻时间点相比较,随着缺血后时间延长,缺血后6 h、12 h、24 h Bmax值逐渐降低(P0.05,vs 0 h),其后Bmax值逐步回升,72 h时间点Bmax值与24 h时间点相比明显上升(P0.05);与全脑缺血组相比,舒巴坦预防组各时间点Bmax值均明显增加(P0.05)。舒巴坦预防+GLT-1 AS-ODNs组中,与缺血后即刻时间点相比较,随着缺血后时间的延长,各时间点Bmax值逐渐降低(P0.05,vs 0 h);与舒巴坦预防组相比,各时间点Bmax值均明显下降(P0.05),表明舒巴坦通过上调GLT-1并增加Bmax的作用被GLT-1 AS-ODNs抑制,而舒巴坦预防+GLT-1 R-ODNs组Bmax值的变化与舒巴坦预防组相比较无显著性变化(P0.05)。2.Kd值的变化与sham组相比,舒巴坦对照组和GLT-1 AS-ODNs对照组各个时间点的Kd值均无显著性变化(P0.05)。全脑缺血组中,与缺血后即刻时间点相比,各个时间点Kd值呈现明显上升的趋势,于24 h-48 h升高最明显;与sham组相比,各个时间点的Kd值均明显升高(P0.05)。舒巴坦预防组中,与缺血后即刻时间点相比,各时间点Kd值变化趋势与全脑缺血组一致;与全脑缺血组相比,各时间点的Kd值均显著降低(P0.05)。在舒巴坦预防+GLT-1 AS-ODNs组中,与缺血后即刻时间点相比,各时间点Kd值无明显变化;与舒巴坦预防组相比,各时间点Kd值均明显升高(P0.05)。而舒巴坦预防+GLT-1 R-ODNs组与舒巴坦预防组Kd值无差异。3.神经病理学评价结果Sham组大鼠海马CA1区锥体细胞形态完整,无细胞缺失,并且排列整齐,层次分明。胞核大而圆,位于细胞中央,核仁清晰,尼氏体丰富。舒巴坦对照组大鼠海马CA1区锥体细胞组织形态与sham组基本一致。在全脑缺血组中,海马CA1区锥体细胞稀疏无层次感,排列紊乱,可见大量细胞碎片,并且出现了明显的神经元缺失,组织学分级显著升高(P0.05),神经元密度显著下降(P0.05)。舒巴坦预防组海马CA1区锥体细胞损伤不明显,其组织细胞形态与全脑缺血组相比明显好转,更接近sham组。与全脑缺血组相比,组织学分级明显降低(P0.05),神经元密度显著升高(P0.05),表明舒巴坦具有抗全脑缺血引起的迟发性神经元死亡的作用。舒巴坦预防+GLT-1 AS-ODNs组海马CA1区组织细胞细胞形态与全脑缺血组类似,也出现了细胞肿胀,崩解,碎片化及核固缩。与舒巴坦预防组相比,其组织学分级显著升高(P0.05),神经元密度明显下降(P0.05),表明GLT-1 AS-ODNs抑制了GLT-1表达从而减弱了舒巴坦对海马CA1区锥体神经元的保护作用;GLT-1 AS-ODNs对照组大鼠海马CA1区组织形态与sham组基本一致,表明侧脑室注射GLT-1 AS-ODNs不会对海马CA1区神经元产生损伤。舒巴坦预防+GLT-1 R-ODNs对照组与舒巴坦预防组大鼠海马CA1区组织形态基本一致。以上结果显示:侧脑室注射GLT-1 AS-ODNs可以抑制舒巴坦的抗脑缺血损伤的神经保护作用。小结:以上结果表明,舒巴坦可以改善全脑缺血大鼠GLT-1的最大结合容量并增强其与谷氨酸的亲和力。第二部分舒巴坦对全脑缺血大鼠海马CA1区GLT-1摄取谷氨酸的影响目的:采用大鼠全脑缺血再灌注模型,观察舒巴坦对脑缺血大鼠海马CA1区GLT-1摄取谷氨酸的影响,探讨舒巴坦对GLT-1功能的影响。方法:实验动物及分组同第一部分。各组大鼠于规定时间点,即全脑缺血后即刻、6 h、12 h、1 d、2 d、3d取材,制备细胞悬液,使用~3H标记的谷氨酸(L-~3H-glutamate)测定海马CA1区细胞对谷氨酸的摄取。GLT-1的谷氨酸摄取量等于总摄取量减去非特异性摄取量。用于病理组织学观察的标本于7 d时取材固定。结果:1.摄取率变化与sham组相比,舒巴坦对照组中GLT-1对谷氨酸的摄取明显增加(P0.05);GLT-1 AS-ODNs对照组中,GLT-1对谷氨酸摄取有一定程度减少(P0.05),说明GLT-1 AS-ODNs可通过抑制GLT-1的表达减少GLT-1对谷氨酸的摄取。全脑缺血组谷氨酸的摄取率呈现下降趋势,在本实验中72 h降到最低(P0.05,vs 0 h)。与sham组相比,随着缺血后时间的延长,摄取率逐渐下降(P0.05)。舒巴坦预防组中,0 h、6 h、12 h、24 h时间点的摄取率虽无明显变化,但有下降趋势,到48 h-72 h时间点,其谷氨酸摄取率明显升高,到72 h时摄取率已明显高于24 h(P0.05,vs 24 h);该组与全脑缺血组相比,GLT-1对谷氨酸摄取在各个时间点均明显增加(P0.05)。舒巴坦预防+GLT-1 AS-ODNs组GLT-1对谷氨酸的摄取明显降低,并且在48 h-72 h时间段内仍在下降(P0.05,vs 0 h);与舒巴坦预防组相比,GLT-1对谷氨酸的摄取显著降低(P0.05)。舒巴坦预防+R-ODNs(18 nmol)组GLT-1对谷氨酸的摄取率的变化趋势与舒巴坦预防组基本一致,各时间点摄取率无明显变化。2.神经病理学评价结果同第一部分结果。3.预防性给予舒巴坦可以有效减轻大鼠海马CA1区锥体神经元的迟发性神经元死亡,并且明显增强大鼠海马CA1区GLT-1对谷氨酸的摄取。而应用GLT-1 AS-ODNs可明显抑制舒巴坦对全脑缺血大鼠神经元的保护作用。小结:这些结果表明舒巴坦可以增加全脑缺血大鼠GLT-1对谷氨酸的摄取。第三部分舒巴坦对全脑缺血大鼠海马CA1区谷氨酸浓度的影响目的:应用大鼠全脑缺血模型,观察舒巴坦对海马CA1区脑微透析液中谷氨酸浓度的影响,进一步探讨舒巴坦抗脑缺血性损伤作用的机制。方法:实验动物及分组同第一部分。各组均于全脑缺血前3 h开始脑内微透析,采集微透析样品用于高效液相联合质谱仪进行分析,观察微透析液中谷氨酸浓度的变化;全脑缺血后7 d取材进行脑组织病理学评价。结果:1.氨基酸的分离情况。在本实验条件下,谷氨酸与内标在6 min内均得以分离,其出峰时间分别为:Asp 1.41 min、Glu 1.50 min、Nor 5.25 min,三种氨基酸峰形良好,无重合、双峰、拖尾等现象(Fig.1)。海马透析液样品中的其他杂峰亦可与待测氨基酸完全分离。2.谷氨酸浓度的变化Sham组脑微透析液中谷氨酸浓度处于较低水平,约2.25±0.361μmol/L,各时间点无明显变化。与sham组相比,舒巴坦对照组脑微透析液中谷氨酸浓度无明显变化。在全脑缺血组中,大鼠海马CA1区谷氨酸浓度出现了明显的升高。在缺血一开始就迅速出现升高,并且迅速升高至基础浓度的7.5倍左右,在恢复血流灌注后,于16 min左右恢复至基础水平。在舒巴坦预防组,给予舒巴坦可明显抑制全脑缺血引起的脑内谷氨酸浓度升高,使其峰值降低到基础浓度的3倍左右,明显低于全脑缺血组(P0.05)。在舒巴坦预防+GLT-1 AS-ODNs组,谷氨酸浓度在全脑缺血后迅速升高,最高浓度为基础值的5.7倍,明显高于舒巴坦预防组(P0.05),表明舒巴坦降低缺血时细胞间隙谷氨酸浓度升高的作用可以被GLT-1AS-ODNs明显抑制。而在舒巴坦预防+GLT-1 R-ODNs中却无此变化,说明本实验选择的GLT-1 AS-ODNs可有效的抑制GLT-1的表达及其对谷氨酸的摄取。给sham组动物注射GLT-1 AS-ODNs组,可使其谷氨酸浓度稍有增高,与sham组比较有统计学差异(P0.05),说明连续3次注射GLT-1AS-ODNs可有效的抑制GLT-1对谷氨酸的摄取。3.神经病理学评价同第一部分结果。小结:以上结果表明,舒巴坦可以降低脑缺血引起的细胞外谷氨酸浓度升高,从而降低其兴奋性神经毒性作用导致的迟发性神经元死亡。结论:1.舒巴坦可以改善全脑缺血大鼠GLT-1的最大结合容量并增强其与谷氨酸的亲和力。2.舒巴坦能够明显增加全脑缺血大鼠海马CA1区GLT-1对谷氨酸的摄取。3.舒巴坦可以降低脑缺血引起的细胞外谷氨酸浓度升高,从而降低其兴奋性神经毒性作用。以上结果表明,舒巴坦可以通过上调GLT-1的功能,降低全脑缺血大鼠海马CA1区谷氨酸浓度,进而发挥抗全脑缺血的神经保护作用。
【学位单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R743.3
【部分图文】：

图 9 各组及时间点 GLT-1 的 Bmax 值折线图Fig.9 Bmax values of GLT-1 at six time points of each groupThe Bmax value of GLT-1 in hippocampal CA1 was determined bradioligand binding assay, and the data was expressed as mean±sem. Thresults showed that the Bmax value of GLT-1 in hippocampal CA1 region wasignificantly increased in the sulbactam-prevention group compared with thglobal cerebral ischemia group. *P<0.05 vs Sham groups;#P<0.05 vs Braiischemia group;△P<0.05 vs Sulbactam prevention group.★P<0.05 vs 0h；◆P<0.05 vs 24h.

图 10 各组及各时间点 GLT-1 的 Kd 值折线图Fig.10 The Kd values of GLT-1 at six time point of each groupThe change in the Kd value of GLT-1 indicates the affinity of GLT-1 foglutamic acid, and the data is expressed as mean±sem. The results showed thafter 8 minutes of 8 min ischemic insult, the affinity of GLT-1 in thsulbactam-prevention group was higher than that in the cerebral ischemgroup. *P<0.05 vs Sham groups;#P<0.05 vs Brain ischemia group;△P<0.05 vSulbactam prevention group.★P<0.05 vs 0h;◆P<0.05 vs 24hTime point (h)

图 1 各组大鼠海马 CA1 区 GLT-1 谷氨酸摄取率变化折线图Fig.1 Changes of GLT-1 glutamate uptake in hippocampal CA1 region in egroup It was found that sulbactam significantly up-regulated glutamate uptin GLT-1 in hippocampal CA1 region in sham-operated rats and glocerebral ischemia rats. However, GLT-1 AS-ODN significantly inhibitedincrease in glutamate uptake induced by sulbactam in global cerebral ischerats in the sulbactam-prevented group.▲P<0.05 vs sham；★P<0.05 vs Bischemia；*P<0.05 vs Sulbactam prevention， P<0.05 vs 0h.Time point (h)
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本文编号：2871544