维生素D缺乏与糖尿病周围神经病变的关系和低温大气压等离子体对糖尿病伤口的治疗作用及机制研究

发布时间：2020-11-06 05:31

　　 目的糖尿病足作为糖尿病患者最常见并发症之一,严重影响患者生存和生活质量。糖尿病足是全世界范围内导致非创伤性截肢的首要原因,但由于其发病机制复杂,迄今仍缺乏有效的治疗方法。因此,探讨糖尿病足的危险因素、寻求新的防治策略具有重要的理论及临床意义。糖尿病足溃疡发病的病因学基础主要是下肢血管病变和周围神经病变,而DPN目前尚缺乏有效的预警指标。本课题拟探讨血清维生素D水平与DPN的关系及其作为DPN早期预警指标的价值。除了糖尿病足危险因素的预警,还需要寻求糖尿病足溃疡愈合的新途径。低温大气压等离子体(CAP)是一种特殊的气体物质,包含多种活性物质,其在生物治疗领域的应用成为新兴研究领域。除了血清标志物,我们进一步研究了CAP对雄性db/db糖尿病小鼠皮肤伤口愈合影响及其中可能涉及的关键通路与靶点蛋白。本课题旨在通过预警与治疗两方面探索改善糖尿病足风险早期识别与足溃疡治疗的新方法。方法入选2型糖尿病患者861例,根据糖尿病控制与并发症研究(DCCT)标准,评估患者临床症状、体征、测定震动感觉阈值及肌电图,根据结果将患者分为3组:无神经病变对照组组,疑似DPN组(具有DPN临床表现或神经电生理检查异常患者)和确诊DPN组(具有DPN临床表现和神经电生理检查异常患者)。维生素D缺乏定义为血清25-羟基维生素D水平低于20 ng/m L。收集患者各项临床信息、生化指标结果并进行统计学分析。糖尿病足伤口研究选用8周龄db/db小鼠,建立2型糖尿病背部皮肤伤口模型,分别予以CAP照射180s/d/只,90s/d/只及对照气吹治疗(每组n=10),连续15天。观察三组小鼠伤口愈合情况,留血样测定小鼠肝肾功能水平,取皮肤组织观察伤口结构病理变化,分离提取蛋白和m RNA,利用Western Blot和Real-time PCR方法测定伤口愈合慢性炎症、氧化应激和血管新生信号通路相关蛋白和m RNA表达情况。结果DPN组患者血清25-羟基维生素D水平(15.59±7.68 ng/m L)显著低于对照组(18.35±6.60 ng/m L)和症状组(17.66±7.50 ng/m L)(p0.01)。较无病变组与疑似组,确诊组具有显著升高的维生素D缺乏率(80%vs.61.7%,64.5%)(P0.01)。在排除性别、年龄、病程、血糖指标、肾功能指标等所有因素的影响后,维生素D缺乏增加患糖尿病周围神经病变的相对危险度(95%可信区间)为2.59(1.48–4.53);多元Logistic回归显示维生素D缺乏是糖尿病周围神经病变(β=0.88,P0.01)的独立危险因素。受试者工作特征曲线(ROC曲线)提示,当血清25-羟基维生素D水平低于16.01ng/ml时,患糖尿病周围神经病变的可能性将升高近2倍。糖尿病伤口研究中,我们发现CAP180s、90s治疗组小鼠伤口愈合速度(0.36±0.09cm2/d;0.32±0.12cm2/d)均显著快于对照组小鼠(0.28±0.11cm2/d,P均0.01)。伤口皮肤HE染色病理观察及免疫组化、免疫荧光结果显示,CAP治疗组伤口周围皮肤炎症细胞浸润显著减少,血管新生增强。Western blot结果显示,CAP治疗后伤口组织血管内皮生长因子(VEGF)和转化生长因子-?(TGF-β)表达增加,白介素-6(IL-6),肿瘤坏死因子(TNF-α),诱导型一氧化氮合酶(i NOS)和超氧化物歧化酶(SOD)表达减少。Real-time PCR测定上述蛋白m RNA结果与此一致(P均0.01)。同时,CAP治疗组小鼠血清谷丙转氨酶(ALT),谷草转氨酶(AST),尿素氮(BUN)和肌酐(Cr)水平与对照组无显著差异。结论维生素D缺乏是2型糖尿病周围神经病变的独立危险因素,血清25-羟基维生素D水平低于16.01ng/ml提示患周围神经病变的风险倍增。低温大气压等离子体能够通过抑制炎症,增强血管、组织新生加快糖尿病小鼠皮肤伤口的愈合,同时对肝肾没有副作用。
【学位单位】：上海交通大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R587.2;R747.9
【部分图文】：

表 1-5 DPN 影响因素的多元逐步回归分析Table 1-4 Multiple logistic regression: independent factors of DPNSE Wald pVDD 0.88 0.32 7.72 < 0.01Age 0.06 0.02 12.21 < 0.01Diabetes duration 0.04 0.02 4.03 0.04注：VDD：维生素 D 缺乏5. 不同血清维生素 D 水平 DPN 患病率的比较根据患者血清25(OH)D水平将患者分为3组：对照组(>30ng/ml, n=51)，VDI组(20~30ng/ml, n=250)和VDD组(<20ng/ml, n=560)。比较3组患者DPN症状及DPN发生比例，结果显示VDD、VDI组患者DPN症状(20.7%; 17.6 %vs. 16.3%)及DPN发生率(12.8%; 9.8% vs. 2.1%)均显著高于对照组(P均< 0.05)。同时VDD组患者DPN症状、DPN发生率也较VDI组患者显著升高(P均< 0.05)。（图 1-1）。由此我们可以看出，DPN患病率随着维生素D水平的降低而升高。

Figure 1-1. Prevalence of signs of DPN and DPN among patients with different 25(OH)D levels.*p < 0.05, ** p < 0.01 vs. Patient with 25(OH)D >30ng/ml; #p < 0.05 vs. Patient with 25(OH)D20~30ng/ml. DPN：糖尿病周围神经病变6. 血清 25(OH)D 水平预警 DPN 的 ROC 分析前面的研究结果提示DPN患者血清25(OH)D水平显著低于其他组患者，同时维生素D缺乏更是DPN发生的独立危险因素。为了验证血清25(OH)D能否作为提示DPN的临床指标，我们利用受试者工作特征（ROC）曲线，分别以DPN及DPN症状为因变量，以血清25(OH)D水平为自变量进行分析。结果显示，提示出现DPN症状的血清25(OH)D的最佳切点值为17.22ng/ml (AUC：0.583; 95% CI,0.645–0.763; 约登指数：0.305; 敏感度，61.8%; 特异度，68.6%)。提示DPN患病的最佳血清25(OH)D切点为16.01ng/ml (AUC：0.614; 95% CI, 0.553-0.675; 约登指数：0.22; 敏感度，66.73%; 特异度，55.72%)（图 1-2）。

图 2-1. 国内自制低温大气压等离子发射设备Figure 2-1. CAP equipment材料与方法1. 实验材料与主要仪器1.1. 实验动物1.11 动物来源及饲养SPF 级别 db/db (+/+) C57/BL/KsJ 雄性小鼠 30 只购自南京大学模式动物有限责任公司。小鼠饲养于上海市第六人民医院动物房，使用普通小鼠饲料喂养，饮用自来水。动物房温度控制在 25℃左右，并使用 12 h 光照周期以模拟小鼠正常昼夜生理规律。1.12 小鼠背部皮肤伤口模型的建立使用小动物麻醉机，小鼠吸入异氟醚、空气的混合气体持续麻醉，俯卧位固定，背部剃毛后，使用脱毛膏脱去残留毛发，清洗残余脱毛膏以免损伤皮肤。使用皮肤打孔器(Integra Miltex , USA)在完全暴露的小鼠背部剪下皮肤，制作
【参考文献】

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本文编号：2872716