脑胶质瘤组织中UHRF1表达及对细胞增殖和凋亡的影响研究

发布时间：2020-11-06 03:58

　　 背景脑胶质瘤是脑部具有高度侵袭性的恶性肿瘤,该原发性脑肿瘤会严重破坏神经系统,预后极差。目前,脑胶质瘤以综合治疗为主,其中胶质母细胞瘤单纯手术治疗并不能给患者带来生存获益,而多项临床研究已证实放疗有助于延长该恶性肿瘤的生存期,如生存期会延长6~8个月。尽管放疗在包括脑胶质瘤在内的脑肿瘤治疗中具有重要意义,但大多数接受放疗者会于原发灶附近复发,严重影响生存质量。因此脑胶质瘤的研究热点多集中在探讨提高脑胶质瘤治疗效果的细胞分子机制。癌症的发生发展涉及多个基因多个环节,其中抑癌基因表观遗传沉默导致的功能抑制在该过程发挥重要作用,如细胞增殖、凋亡、信号转导及DNA修复凋亡过程。表观遗传沉默是脑胶质瘤研究的有力切入点。DNA甲基化在表观遗传沉默中较为常见,多种酶参与了甲基化的调节过程,其中DNA甲基转移酶(DNMT)是负责建立和维护DNA甲基化的关键酶。UHRF1(ubiquitin-like wih PHD and ring finger domains1,泛素样含PHD和环指域1)是目前DNA甲基化过程研究较多的蛋白,在多种恶性肿瘤中表达失调,该因子可与半甲基化的DNA结合,被证实在甲基化维持中发挥重要作用,如UHRF1可诱导DNMT和蛋白脱乙酰基酶招募至DNA。新近研究表明UHFR1是一个重要的致癌基因,可在恶性肿瘤的发生发展过程中来调节基因表达和染色质修饰。尽管UHRF1在DNA甲基化所必须的因子,但目前其在脑胶质瘤中的表达模式尚不清楚,具体的作用方式也罕见报道。故本研究首先采用实时定量PCR(QPCR)检测胶质母细胞瘤组织中的UHRF1 mRNA水平,进一步分析该基因表达与脑胶质瘤临床病理参数的关系,同时在脑胶质瘤U251细胞中通过外源基因干扰手段来沉默UHRF1表达,来评价该蛋白对U251细胞增殖凋亡的影响,为揭示脑胶质瘤的发病机制及靶向治疗靶点提供理论依据。目的1.确定脑胶质瘤组织中UHRF1表达是否异常和具体表达模式。2.分析UHRF1水平与脑胶质瘤临床病理参数的关系,进一步确定UHRF1是否参与了脑胶质瘤的发生发展。3.在体外沉默UHRF1表达对脑胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响。方法收集本院2014年1月至2016年12月经手术切除的脑胶质瘤组织44例及37例正常脑组织,采用实时荧光定量PCR(QPCR)检测以上组织中的UHRF1 mRNA水平,分析脑胶质瘤组织UHRF1 mRNA水平与脑胶质瘤主要临床病理学参数(年龄、性别、病理类型、分化程度、病理分级、瘤周水肿和浸润深度)的关系;采用受试者工作特征曲线(ROC)分析组织UHRF1 mRNA从正常脑组织区分脑胶质瘤的效能及脑胶质瘤不同临床病理参数的效能。采用脂质Attractene reagent法将靶向沉默UHRF1表达的短发夹RNA(shRNA)载体LV-UHRF1-shRNA及阴性对照载体LV-scramble-shRNA分别转染至U251细胞(LV-UHRF1-shRNA组和LV-scramble-shRNA组),以仅转染脂质体的细胞为对照组;采用实时荧光定量PCR(QPCR)检测各组转染48 h后的UHRF1 mRNA水平,采用MTT法检测各组转染24、48、72 h的增殖情况,BrdU染色法检测转染12、24、48、72 h后的BrdU阳性率,Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测转染48、72 h后的凋亡率,Western blotting检测转染72 h后的凋亡相关蛋白(Bax、Caspase-3和Bcl-2)水平。结果1.QPCR检测37例正常脑组织和44例脑胶质瘤组织中的UHRF1 mRNA水平发现,脑胶质瘤组织的UHRF1 mRNA水平为2.668± 1.856,高于正常脑组织的1.217±0.741,差异有统计学意义(P0.05)。UHRF1mRNA水平从正常脑组织中区分脑胶质瘤组织的曲线下面积(AUC)为0.735[95%CI:0.628~0.843,P0.001],以2.895为截断值时约登指数最高为0.386,灵敏度为38.64%,特异度为100.00%。2.UHRF1 mRNA水平与年龄、性别、病理类型及瘤周水肿无关(P0.05),与分化程度、病理分级和浸润深度有关(P0.05),其中低分化的UHRF1 mRNA水平为3.526± 1.736,高于高、中分化的2.075±1.726,病理分期Ⅲ、Ⅳ期的UHRF1 mRNA 水平为 3.182± 1.759,高于 Ⅰ、Ⅱ 期的 1.993± 1.803,浸润深度1/2 的 UHRF1mRNA 水平 3.562±1.903,高于≤ 1/2 的 2.106±1.618,以上差异均有统计学意义(P0.05)。3.以脑胶质瘤组织UHRF1 mRNA水平的均值(2.668)为界值将44例患者分为低表达组25例和高表达组19例。本研究分析UHRF1 mRNA水平分布与年龄、性别、病理类型、分化程度、病理分级、瘤周水肿和浸润深度的关系,结果显示UHRF1 mRNA水平分布与年龄、性别、病理类型及瘤周水肿无关(P0.05),与分化程度、病理分级和浸润深度有关(P0.05),其中低分化的UHRF1高表达率为66.67%(12/18),高于高、中分化的26.92%(7/26),病理分期Ⅲ、Ⅳ期的UHRF1高表达率为56.00%(14/25),高于Ⅰ、Ⅱ期的26.32%(5/19),浸润深度1/2 的 UHRF1 高表达率为 64.71%(11/17),高于≤ 1/2 的 29.63%(8/27),以上差异均有统计学意义(P0.05)。4.QPCR结果显示转染48 h后各组的UHRF1 mRNA水平发现,LV-UHRF1-shRNA组的UHRF1 mRNA水平为0.309±0.073,对照组的UHRF1 mRNA水平为1.098±0.136,LV-scramble-shRNA 组的 UHRF1 mRNA 水平为 1.127 ± 0.193,LV-UHRF1-shRNA 组的 UHRF1 mRNA 水平均低于对照组和 LV-scramble-shRNA 组(P0.05),对照组和LV-scramble-shRNA组UHRF1 mRNA水平的差异无统计学意义(P0.05)。5.采用MTT法检测转染0、24、48、72 h后三组U251细胞的增殖水平,结果显示与对照组和LV-scramble-shRNA组相比,LV-UHRF1-shRNA组在以上时间点细胞增殖率降低,差异有统计学意义(P0.05);对照组和LV-scramble-shRNA组以上时间点增殖率的差异无有统计学意义(P0.05)。6.采用BrdU染色法检测转染12、24、48、72 h后三组U251细胞的BrdU阳性率,结果显示与对照组和LV-scramble-shRNA组相比,LV-UHRF1-shRNA组在以上时间点细胞BrdU阳性率降低,差异有统计学意义(P0.05);对照组和LV-scramble-shRNA组以上时间点BrdU阳性率的差异无有统计学意义(P0.05)。7.采用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测转染72 h后三组U251细胞的凋亡率,结果显示对照组、LV-scramble-shRNA组和LV-UHRF1-shRNA组的凋亡率分别为(7.73±0.66)%、(7.86±0.59)%和(25.71±1.87)%,LV-UHRF1-shRNA组的凋亡率高于对照组和LV-scramble-shRNA组,差异有统计学意义(P0.05);对照组和LV-scramble-shRNA组凋亡率的差异无有统计学意义(P0.05)。8.采用Western blotting检测染72 h后三组U251细胞的凋亡相关蛋白的表达情况,结果显示与对照组和LV-scramble-shRNA组相比,LV-UHRF1-shRNA组的Bax、Caspase-3水平升高,而Bcl-2水平降低,差异有统计学意义(P0.05);对照组和LV-scramble-shRNA组凋亡相关蛋白水平的差异无有统计学意义(P0.05)。结论1.脑胶质瘤组织中UHRF1水平异常升高,且对脑胶质瘤的诊断有较好的效能。2.UHRF1表达升高参与了脑胶质瘤的发生发展。3.沉默UHRF1表达可抑制脑胶质瘤的增殖并诱导凋亡。
【学位单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R739.41
【部分图文】：

病理分期ＩＩＩ、ＩＶ期的ＵＨＲＦｌｍＲＮＡ水平为３．１８２±１．７５９，高于Ｉ、ＩＩ期的??１．９９３±丨．８０３，浸润深度＞１／２?的?ＵＨＲＦ１?ｍＲＮＡ?水平?３．５６２±１．９０３，高于￡１／２?的??２．１０６土?１．６１８，以上差异均有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。见表２、图２。??Ａ?８１?Ｂ?８－Ｊ?０?８－，??￥？．?．．．?％，－?■■■?％，．?■??１－?？?／?％－?？？?：?１－?＼?■??［?Ｈ?ＬＬ?？？?■：??Ｘ?２－?■■■■?Ｉ?Ｊ－?＊？？？？？?Ｉ?２＇?？？？＊?■■■■■??〇?”？?〇Ｊ?＊?〇?？秦???Ｓ５０岁?＞５０岁?女?男?Ｒ达Ｅ）编鼴琀?星形齩换编鼴癟??Ｄ?８＊｜?Ｅ?８－｜?Ｆ?８－??？?■■?％，．?．．．?．．．??＜?？參鲁?■■■?＜?？？?？?＜?參參參?■■??ｉ?．?？?ｃ?．?？?■■■?ａ?４．?？？?■??Ｅ?４＇?＿?Ｅ?＊■?■?Ｅ?４．?？??〇Ｊ＿?，??〇Ｊ＿?；??〇Ｊ?＾＾—??￡．中?ｆｔ?ｉ、ｎ?ｍ、ｉｖ?ｆｔ度?中？鑫度??Ｇ?８－??５?６－?？

的ＵＨＲＦ１高表达率为５６．００％?（１４／２５），高于Ｉ、ＩＩ期的２６．３２％?（５／１９），浸润??深度＞１／２?的?ＵＨＲＦ１?高表达率为?６４．７１％?（１１／１７），高于￡１／２?的?２９．６３％?（８／２７），??以上差异均有统计学意义（Ｐ＜〇．〇５）。见表３、图３。??Ａ?８１?Ｂ?＊－｜?Ｃ?？－｜??Ｂ－???＜＊－??５?丁?￣１￣￣?ｉ?丁?￣１￣?ｉ?￣１￣?，丁??Ｃ??１??ｕ；?Ｃ??？２－?????｜?２－?????｜?２－?????Ｄ?■?—?Ｊ?Ｉ?Ｌ?Ｉ?］?Ｉ?■?Ｉ?■?Ｉ?Ｄ??????Ｊ?—Ｌ－?＼?Ｊ?—＿ｊ＿?Ｊ?＿Ｌ?—Ｌ－??〇?Ｓ５０岁?＞５０岁?女?宄?Ｒｆｉ母编ｆｔ＊?１形？达编跑＊??Ｄ?Ｅ?＊１?Ｆ?＊■??Ｍ－?Ｗ－??＊?６．?—Ｔ—?—ｒ－?＊?Ｓ－?—Ｔ—?＊?？■?—ｆ－??ｌ?丨丁?ｌ?Ｔ?￣１￣?＾?￣１￣｜?丁????１?心??茔?２－????Ｉ?空?２－?Ｌ?Ｊ?茔?２－??????＼?ｔ＝＾ｉ?ＪＴ?＼?Ｌｚｒ＾?ｔ＾ｄ??＾?寘．中?ｆｔ?°?ｉ?．?ｎ?ｍ、ｉｖ?°?ｆｉ度?中、鑫癀??Ｇ?？？??ｗ－??＊６．?——?￣｜￣??ｂ－??＜１ｆ２?＞１ｆ２??Ａ：年

０．５７７￣０．８９２，?Ｐ＝０．００８］和?０．７３６［９５％ＣＩ：?０．５８１?？０．８９２，?Ｐ＝０．００９］，约登指数为?０．４３６、??０．５２４?和?０．４３１，敏感度为?６６．６７％、８４．００％和?７６．４７％，特异度为?７６．９２％、６８．４２％??和６６．６７％。见表４、图４。??ａ?，００１?－―＾?ｂ?，０〇ｉ?ｃ?，Ｍｉ?ｐｚｒ－??《ｙ?ｉ?ｔ?＊°?｜—??１?？．?１?？■?Ｊ／?１?？■?，＿Ｉ??５?—ｒ－１?／?５?ｒ－ｉ—＾?Ｓ?Ｊ??２０－?２０－??０－Ｕ—￣Ｉ?．?．?．?１?〇４＾???１?．?．?ｏ－ｌ￣?，?，?，???０?２０?４０?６０?８０?１００?０?２０?４０?６０?８０?１００?０?２０?４０?ＳＯ?８０?１００??１００％?－?Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ＾
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本文编号：2872619