RTN1-C在高糖加重神经细胞糖氧剥夺损伤中的作用及机制研究

发布时间：2020-11-11 10:50

　　 背景:糖尿病(Diabetes mellitus,DM)是脑血管疾病发病率以及死亡率增加的独立性危险因素,与缺血性脑卒中的发生、发展关系密切。在急性脑梗死患者中,糖尿病病人脑梗死面积更大,临床预后更差,死亡率也增加,但其具体机制尚未完全清楚。内质网应激(Endoplasmic reticulum stress,ER stress)是脑缺血再灌注损伤(Ischemia reperfusion injury,IRI)的重要机制之一,也是糖尿病和其并发症的病理形成过程中的重要参与者。RTN1-C是内质网膜相关蛋白,调节多种细胞内通路,参与内质网应激介导的细胞凋亡。有研究表明,上调RTN1-C蛋白的表达会加重脑缺血再灌注的损伤。目的:本研究拟在鼠的神经母细胞瘤N2a氧糖剥夺后复氧(OGD/R)的损伤模型中,研究RTN1-C在高糖培养加重神经细胞氧糖剥夺损伤中的作用。方法:鼠的神经母细胞瘤N2a在含有10%的胎牛血清的DMEM/F12培养基中培养和传代,接种于96孔板(100μl/孔)、12孔板(1 ml/孔)或6孔板(2 ml/孔),接种密度大约为105个/m L,接种12 h后细胞贴壁,换为高糖(HG组,30 mmol/L)DMEM培养基培养48h建立高糖模型。使用随机数字表的方法,将细胞分为10组:对照组(NG-CON组)、氧糖剥夺组(NG-OGD/R组)、4-PBA预处理组(NG-OGD/R+4-PBA组)、空白转染组(NG-sh NC组)、RTN1-C敲低转染组(NG-sh RTN1-C组)、高糖对照组(HG-CON组)、高糖氧糖剥夺组(HG-OGD/R组)、高糖4-PBA预处理组(HG-OGD/R+4-PBA组)、高糖空白转染组(HG-sh NC组)、高糖敲低转染组(HG-sh RTN1-C组)。其中NG-OGD/R组、NG-OGD/R+4-PBA组、NG-sh NC组、NG-sh RTN1-C组、HG-OGD/R组、HG-OGD/R+4-PBA组、HG-sh NC组与HG-sh RTN1-C组弃去培养液,加入不含糖及血清的培养基,将培养板放入缺氧装置内,并通入含有5%CO2-95%N2的混合气平衡,缺氧培养3h后取出,更换为含有10%胎牛血清的相应糖的DMEM培养基于37℃,5%CO2-95%N2细胞孵育箱常规培养2h。其中NG-OGD/R+4-PBA组和HG-OGD/R+4-PBA组在氧糖剥夺前加入终浓度为2 mmol/L4-PBA的DMEM培养基孵育2 h;NG-OGD/R+sh NC组、HG-OGD/R+sh NC组、NG-OGD/R+sh RTN1-C组与HG-OGD/R+sh RTN1-C组在氧糖剥夺前24h,分别转染sh NC或sh RTN1-C质粒。于复氧结束时,采用CCK-8试剂来检测细胞活力,PE Annexin V/7-AAD流式细胞术来检测细胞凋亡,Western Blot来检测细胞内蛋白RTN1-C、GRP78、cleaved-caspase-12、CHOP和cleaved-caspase-3的表达水平。结果:1.细胞活力与NG-CON组比较,NG-OGD/R组细胞活力降低(P0.05);与NG-OGD/R比较,NG-OGD/R+4-PBA组细胞活力升高(P0.05);与HG-CON组比较,HG-OGD/R组细胞活力降低(P0.05);与HG-OGD/R比较,HG-OGD/R+4-PBA组细胞活力升高(P0.05);与NG-OGD/R组比较,HG-OGD/R组细胞活力降低(P0.05);与NG-OGD/R+4-PBA组比较,HG-OGD/R+4-PBA组细胞活力无统计学意义(P0.05);与NG-sh NC比较,HG-sh NC组细胞活力降低(P0.05);与NG-sh RTN1-C比较,HG-sh RTN1-C组细胞活力无统计学意义(P0.05)。2.细胞凋亡率与NG-CON组比较,NG-OGD/R组细胞的凋亡率升高(P0.05);与NG-OGD/R比较,NG-OGD/R+4-PBA组细胞凋亡率降低(P0.05);与HG-CON组比较,HG-OGD/R组细胞凋亡率升高(P0.05);与HG-OGD/R比较,HG-OGD/R+4-PBA组细胞凋亡率降低(P0.05);与NG-OGD/R组比较,HG-OGD/R组细胞凋亡率升高(P0.05);与NG-OGD/R+4-PBA组比较,HG-OGD/R+4-PBA组细胞凋亡率无统计学意义(P0.05);与NG-sh NC比较,HG-sh NC组细胞凋亡率升高(P0.05);与NG-sh RTN1-C比较,HG-sh RTN1-C组细胞凋亡率无统计学意义(P0.05)。3.蛋白含量变化与NG-CON组比较,NG-OGD/R组RTN1-C、GRP78、cleaved-caspase-12、CHOP及cleaved-caspase-3蛋白含量增加(P0.05);与NG-OGD/R比较,NG-OGD/R+4-PBA组GRP78、cleaved-caspase-12、CHOP及cleaved-caspase-3蛋白含量减少(P0.05);与HG-CON组比较,HG-OGD/R组RTN1-C、GRP78、cleaved-caspase-12、CHOP及cleaved-caspase-3蛋白含量增加(P0.05);与HG-OGD/R比较,HG-OGD/R+4-PBA组GRP78、cleaved-caspase-12、CHOP及cleaved-caspase-3蛋白含量减少(P0.05);与NG-OGD/R组比较,HG-OGD/R组RTN1-C、GRP78、cleaved-caspase-12、CHOP及cleaved-caspase-3蛋白含量增加(P0.05);与NG-OGD/R+4-PBA组比较,HG-OGD/R+4-PBA组GRP78、cleaved-caspase-12、CHOP及cleaved-caspase-3蛋白含量无统计学意义(P0.05);与NG-sh NC比较,HG-sh NC组GRP78、cleaved-caspase-12、CHOP及cleaved-caspase-3蛋白含量增加(P0.05);与NG-sh RTN1-C比较,HG-sh RTN1-C组GRP78、cleaved-caspase-12、CHOP及cleaved-caspase-3蛋白含量无统计学意义(P0.05)。结论:高糖培养能加重神经细胞OGD/R的损伤,且增加神经细胞RTN1-C蛋白含量。上调的RTN1-C加剧内质网应激介导的细胞凋亡,可能是高糖加重神经细胞OGD/R损伤的重要机制。
【学位单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R587.1;R743.3
【文章目录】：
英文缩略词表
中文摘要
英文摘要
1 前言
2 材料与方法
3 结果
4 讨论
5 结论
6 参考文献
附录
致谢
综述
    参考文献

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本文编号：2879089