ZSTK474对实验性自身免疫性神经炎治疗作用的实验研究

发布时间：2020-11-12 08:09

　　 研究背景及目的:吉兰巴雷综合征(Guillain-Barrésyndrome,GBS)是以周围神经系统(peripheral nervous system,PNS)的髓鞘脱失和炎性细胞浸润为特点的自身免疫性神经病,表现为肢体对称性弛缓性瘫痪,累及呼吸肌可致死,部分患者遗留严重的神经功能障碍。实验性自身免疫性神经炎(experimental autoimmune neuritis,EAN)是众所周知的GBS的经典动物模型。辅助性T细胞(helper T cell,Th)其中的Th1/Th17细胞是实验性自身免疫性神经炎(EAN)的炎症和免疫过程的必要参与者。由于Th1/Th17细胞是促炎细胞并且都分泌促炎细胞因子,抑制Th1和Th17分化并减少炎症因子的药物将具有治疗潜力。ZSTK474[2-(2-difluoromethylbenzimidazol-1-yl)-4,6-dimorpholino-1,3,5-triazine],I类PI3K抑制剂,在癌症、自身免疫性脑脊髓炎及类风湿性关节炎等疾病中被广泛研究,具有抗炎和免疫调节的潜能。然而,ZSTK474对吉兰-巴利综合征(GBS)的潜在治疗作用和精确机制尚不明确。迄今为止,多种应用于GBS治疗的可能药物均在EAN动物模型进行验证,但是ZSTK474在GBS中的作用及其机制目前尚未被探索。为了解决这一科学问题,我们团队将ZSTK474应用于EAN模型,在大鼠的临床症状初发时进行药物干预,收集并整理相关数据,包括临床评分、炎细胞浸润及脱髓鞘程度、肌电图检测结果、Th1/Th17表型的分布等;通过分析及评价PI3K抑制剂,ZSTK474,在GBS动物模型上的疗效,探讨相关的信号通络,以期找到它发挥作用的机制。研究方法:我们通过皮下注射周围神经系统抗原P0_(180-199)在Lewis大鼠中诱导EAN。将这些EAN大鼠随机分成对照组和ZSTK474处理的治疗组。记录大鼠每日的临床评分及体重,通过Mann-Whitney U检验评估临床评分以及电生理学和组织病理学变化。在疾病高峰期,通过大鼠坐骨神经的肌电图检测结果来评价坐骨神经损伤程度,主要评价指标为运动神经传导速度(motor nerve conduction velocity,MNCV),诱发复合肌肉动作电位(compound muscle action potential,CMAP)等,后者潜伏期及波幅,不仅能够有利于诊断,还可以评估转归。之后,留取EAN大鼠的坐骨神经,进行HE和快蓝染色来评价炎细胞浸润和髓鞘脱失程度,并通过免疫荧光技术来探索Th17细胞的变化;同时对坐骨神经进行蛋白提取,并通过蛋白印迹技术验证PI3K通路相关蛋白的改变。留取坐骨神经的同时,留取大鼠脾脏,来获得单个核细胞(Mononuclear cell MNC),用来分析淋巴细胞增殖情况,通过酶联免疫吸附试验和聚合酶链式反应分析各种炎性因子的水平,进一步通过流式细胞术检测CD4~+T细胞的变化。通过GraphPad Prism 5.0软件分析统计相关数据的差异,p0.05时,代表有统计学意义,p0.01,两组间差异显著。研究结果:1.ZSTK474处理后,与HPC处理后比较,前者能使EAN大鼠在疾病最严重时的分值下降,能减轻EAN大鼠周围神经损伤的严重程度。同时还减少了临床运动缺损曲线的曲线下面积(p0.01)。与对照组相比,ZSTK474治疗组具有更少的炎细胞浸润数量(p0.01),更轻的髓鞘脱失(p0.05)。2.坐骨神经肌电图检测结果显示,治疗组MNCV明显增快(p0.01),CMAP波幅显著增高(p0.05),潜伏期明显缩短(p0.01)。3.流式细胞术分析脾单个核细胞结果表明,ZSTK474治疗组Th1/Th17数量较对照组有明显减少。说明ZSTK474抑制Th细胞向Th1/Th17极化。P_(0180-199)刺激后,与对照组相比,ZSTK474治疗组的降低了淋巴细胞的增殖,统计学差异具有意义(p0.01)。4.应用免疫荧光技术来了解Th17在神经组织的浸润情况,结果表明,ZSTK474治疗组相比对照组均显示Th17细胞表型表达下降(p0.01),Western印迹分析显示ZSTK474治疗组p-STAT3表达下降(p0.01)。5.ELISA结果显示:与对照组相比,ZSTK474治疗组促炎症因子(IL-1α,IL-1β,IFN-γand TNF-α)在蛋白水平上在表达量显著下降,其他因子没有显著差异。RT-PCR在翻译水平上也得到了同样的结果,IFN-γ和TNF-α在治疗组下降显著,除此之外,IL-17和IL-23在治疗组也显著减少,表明ZSTK474对促炎因子具有抑制作用。6.Western印迹分析对于EAN大鼠坐骨神经切片中p-Akt、p-mTOR、p-P70S6K、和p-4E-BP1分析结果显示:与对照组相比,ZSTK474治疗组中p-Akt、p-mTOR、p-P70S6K和p-4E-BP1表达均减少。研究结论:我们的研究结果表明ZSTK474有效减轻EAN的症状,该机制涉及PI3K/AKT/mTOR通路的抑制,从而影响Th1/Th17细胞的分化,进一步减少促炎细胞因子的产生。对ENA大鼠具有抗炎、免疫调节及神经保护作用。因此,ZSTK474可能作为治疗GBS的一个候选药物。
【学位单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R745.43
【部分图文】：

结果1 ZSTK474 改善 EAN 大鼠临床症状，减轻 EAN 大鼠的组织学变化和减少炎症细胞聚集1.1 ZSTK474 改善了 EAN 大鼠的临床症状EAN 大鼠被随机分为对照组及 EAN 治疗组（图 1）。治疗组是在免疫后第 7天左右（首次出现症状时）给予 ZSTK474，通过灌胃给予溶于 HPC 中的 ZSTK474（30mg / kg 体重/天）。对照组也是在免疫后约第 7 天（出现首发症状）后给载体 HPC，临床评分不存在统计学差异，临床评分的结果表明，在 ZSTK474 治疗组，临床评分低于对照组(每 1 组在每 1 个时间点分别比较， p < 0.05，图 1A)。对照组与 ZSTK474 治疗组相比临床评分的平均峰值显著增高（HPC：7.25±0.1708;ZSTK474：4.5±0.2582; p <0.01，图 1B), 此外，我们还观察到了治疗组与对照组相比 AUC 的降低（图 1C; p <0.01）。与对照组相比较，ZSTK474 治疗组减轻了EAN 大鼠的临床神经功能的缺损。

图 2、EAN 大鼠的坐骨神经的组织病理学检测在免疫后的第 16 天，取出 EAN 大鼠的坐骨神经用于 H＆E 染色（A）以评估炎症细胞浸润和 LFB 染色（C）以观察脱髓鞘。选择每组的代表性显微照片。A 中的箭头指向炎症细胞，C 中的箭头表示脱髓鞘。每 mm2组织切片的炎症细胞的平均数目显示在 B 中。平均组织学评分显示在 D 中。统计方法应用 Mann-Whitney U 检验。A 和 C 中的比例尺为 10μm。结果表示为平均值±SEM（* p <0.05，** p <0.01 用于两组之间的比较，n =每组 6 只大鼠/组用于临床评分，n = 6 只大鼠/组用于染色）。实验重复 3 次，获得相似的结果。 HPC：对照组，ZSTK474：治疗组。2 ZSTK474 减轻 EAN 诱导的周围神经损伤EAN 大鼠典型神经生理学表现为：神经传到速递减慢、复合动作点位波幅下降及复合动作点位潜伏期延长。我们对 EAN 大鼠进行了腓肠肌和坐骨神经的电生理检查。结果表明， EAN 大鼠坐骨神经的电生理显示 ZSTK474 治疗组具有下降的的 CMAP 幅度，增快的 MNCV 和缩短的 CMAP 潜伏期（图 3A，B）。与对照组相比，MNCV 在治疗组中显著增快（HPC：38.27±1.915m / s ZSTK474：56.55±4.19m/s; p <0.01，图 3C）。CMAP 幅度在治疗组升高（HPC：10.88±1.482mV，

图 3、ZSTK474 减轻了 EAN 诱导的周围神经损伤。图 3A,B 显示了运动神经 CMAP 的代表性肌电图。 刺激位点是坐骨神经的踝区域（A）或腓骨头（B）。与对照组相比，ZSTK474 治疗组显示增加了 EAN 大鼠的平均 MNCV（C），增加了 CMAPs 的振幅（D）并且缩短了 CMAP 的远端运动潜伏期（E）。使用 Mann-WhitneyU 检验比较对照组和 ZSTK474 治疗组之间的差异。显示的数据是平均值±SEM（* p <0.05，** p <0.01，每组 6 只大鼠用于对照和 ZSTK474 治疗组之间的比较;）。 实验重复 3 次，获得相似的结果。 HPC：对照组，ZSTK474：治疗组; MNCV：运动神经传导速度; CMAP：复合肌肉动作电位。3 ZSTK474 抑制了 CD4+T 细胞的分化并抑制淋巴增殖反应3.1ZSTK474 抑制了 CD4+T 细胞分化分化成 Th1 / Th17 细胞为了评估 ZSTK474 治疗组对 CD4+T 细胞分化的影响，如上所述，在疾病高峰期从大鼠的脾脏中分离 MNC。然后通过使用流式细胞术计算脾 MNC 中的CD4+T 细胞。与对照组相比，ZSTK474 治疗组脾 MNC 中 Th1 CD4+IFN-γ+细胞（图 4A，B）的百分比低于治疗组（p <0.01）。此外，ZSTK474 处理降低了CD4+IL-17+Th17 细胞的百分比（图 4E，F，p <0.05）。然而，与对照组相比，
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本文编号：2880506